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向非血液制品行业的大概介绍一下行业现状

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药徒
发表于 2016-1-23 22:56:34 | 显示全部楼层 |阅读模式

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向非血液制品行业的大概介绍一下行业现状
1 血液制品现状
    国外在治疗和预防用血浆蛋白制品已发展到较高水平,这不仅表现在血浆蛋白分离技术的发展,也表现在血浆蛋白制品种类增加,包括重组FⅧ进入市场,而且在质量上保证安全有效。目前世界市场销售的血浆制品共7大类20余种,包括血容扩充剂,免疫凝血因子,抗凝、纤溶、蛋白酶抑制剂和创伤愈合剂。各类血液制品市场销售份额分布为:白蛋白13%,IVIg 43%,高效价免疫球蛋白8%,FⅧ14%,FⅨ3%,其它占19%。
    国内有30余家经国家批准的定点生产血液制品单位,在1998年全行业通过GMP认证,年处理原料血浆3 000—4 000吨,采用国家批准的低温乙醇法,目前国内生物制品市场销售的品种有白蛋白、免疫球蛋白(肌注、静脉、特异性)、Ⅷ因子、凝血酶原复合物、纤维蛋白胶等。因血浆综合利用度不够,各个品种所占市场份额极不均衡:白蛋白占75%,免疫球蛋白占20%,其余品种为5%。了解全球血液制品的研发趋势,特别是血液制品临床应用发生的变化、市场份额、制品安全性以及生产工艺的不断改进等,将会对我国血液制品行业的发展和走向起到一定借鉴,甚至指导作用。
    2 低温乙醇法
    目前,低温乙醇法仍是世界血浆蛋白分离工业,如白蛋白和免疫球蛋白2大主导制品通用的分离方法。然而低温乙醇法也有缺点:乙醇是已知的蛋白变性剂,它对血浆中某些蛋白有变性作用,常常是不可逆转的。例如人血浆中具有抗动脉硬化功能的高密度脂蛋白,在分离过程中其活性被乙醇不同程度的灭失,至今还没有分离出高密度脂蛋白浓缩物用于临床;另外也不适于血浆中不稳定蛋白成分的分离,包括凝血因子和蛋白酶抑制剂,它可能导致蛋白完全丧失生物活性、或引起蛋白结构改变、或形成新的抗原决定簇。60多年来,传统的低温乙醇法(Cohn方法)已经有了很大改进,这些改进增加了提供高纯度蛋白的可能性,特别是对一些特殊的蛋白成分,已在乙醇分离程序中引入层析或完全用层析技术替代了它。现在层析技术和超滤技术已经很好地同主干乙醇法结合,这有助于降低成本,提高生产能力,改善分离组分的质量,特别是白蛋白聚合体的形成。人们已经发展了许多新方法来分离血浆中的一些特殊的蛋白成分,并且与主干低温乙醇法能很好结合,如凝胶层析法,亲和层析法和免疫亲和层析法等。总之,新技术和新方法与低温乙醇法有机结合形成了一个连续的从血浆中分离若干新的蛋白成分方法,增加了人血浆宝贵资源的利用率,如以新鲜冰冻血浆为原料使用层析法和低温乙醇法相结合,通过离心或压滤、超滤等技术可制得数10种血浆制品(各类凝血因子及白蛋白、免疫球蛋白类)。
    3 引入层析技术
    在低温乙醇法发展中,最值得注意的变化之一,就是引入离子交换材料,用于生产中,不是作为主要的纯化手段,就是用于改善成品的纯度(稳定性)。GE(Pharmacia)、TOSOH及BioRad等美日公司开发了一系列离子交换材料,用于蛋白质分离,例如交联葡聚糖凝胶(Sephadex)(交联)琼脂糖凝胶(Sepharose,Sepharose CL及Sepharose FF,TOYOPEARL及TRSacryl、Sephacryl等填料)。这些填料在未接离子交换基团时可用于凝胶过滤(分子筛色谱),在联接了DEAE、QAE、CN、SP等离子交换基团后就成为离子交换材料。联接上赖氨酸、肝素、汽巴蓝或明胶等亲和官能团后就成为亲和层析填料。这些吸附剂特异性强、操作简单、周期短、易自动化,往往一两步层析就能替代多步沉淀,同时生产出的制品纯度高、产率大、蛋白不易变性,污染机会也少。Curling已应用离子交换剂制备白蛋白,随后分离一些凝血因子、IgG和其它有治疗或预防作用的血浆成分。
     3.1 在白蛋白制备中的应用 层析在白蛋白生产中的运用方式:1)使用亲和层析法结合离子交换层析,回收FⅣ沉淀中的白蛋白粗制品,最后结合低温乙醇法制成成品;2)使用离子交换层析作为纯化、凝胶过滤做为去除白蛋白制品中的聚合体。也有极少数公司采用全层析法大规模生产人血白蛋白。
    3.1.1 采用亲和层析法结合离子交换法从低温乙醇中提取人白蛋白据报道,低温乙醇法FⅣ沉淀中含有白蛋白 (9600±1352)g/kg,15倍生理盐水磷酸缓冲液可溶解其中的8744%[约(8394±11119)g/kg],通过DEAE AffiGel Blue 亲和层析及DEAESepharose FF 离子交换层析两步分离的纯化工艺,可从FⅣ溶解液中回收白蛋白(4818±1.118)g/kg FⅣ,回收率为5740±1.94%。白蛋白溶液呈淡黄色,澄清透明,纯度为(9828±168)%,单体含量(9700±219)%,吸收度为(2.8±06)%。白蛋白试制品能耐受57℃、50h热稳定性试验,各检测指标显示,通过亲和层析综合阴离子交换层析回收纯化的白蛋白制品各主要生化指标符合质检要求[1]。
     3.1.2 低温乙醇法结合液相层析法纯化人血白蛋白 其操作要点是:取低温乙醇法制备的FⅣ上清液调整pH至52,将溶液浓缩至蛋白浓度8%,电导14mS/cm,上DEAE Sepharose Fast Flow柱,流穿溶液废弃,用 pH 45—47的醋酸缓冲液洗脱,收集洗脱峰,将洗脱液浓缩至蛋白浓度7%,pH至52,电导14mS/cm,在55℃加热3h,离心去沉淀后,上清调整pH60,上SephacryS200 HR 柱凝胶过滤,洗脱时溶液中的杂蛋白如球蛋白、多聚体或蛋白聚合物先从柱中流出,白蛋白后流出收集第2个峰即为白蛋白。使用此工艺生产的白蛋白其收率可达到(25±05)g/L血浆,单体达到990%—993%,二聚体07%—10%,无多聚体,PKA(前激肽释放酶活性)<5IU/ml,AL离子含量<50μg/L[2],其达到欧洲药典要求。
     3.1.3 白蛋白全层析工艺 GE(Pharmacia)公司报道这项工艺的大致步骤如下:收集SephadexTM G25 Coarse 凝胶过滤的脱盐血浆,沉淀去除优球蛋白后,血浆经DEAE Sepharose FF阴离子交换柱纯化,在特定条件下该介质能结合白蛋白,而IgG组份则不被凝胶吸附而从柱中流穿,然后将结合在凝胶上的白蛋白洗脱下来,用CMSepharose FF阳离子交换柱进一步纯化,最后一步层析是将纯化的白蛋白通过凝胶过滤介质SephacrylTM S200 HighResolution 去除大分子物质。采用该工艺制得的白蛋白溶液纯度>98%且无聚合体,PKA<10IU/ml,并且铝离子含量<20μg/L。此制品巴氏消毒法,质量达到美国和欧洲药典要求。GE公司称由层析方法生产的白蛋白引起副作用的报道病例,比用低温乙醇法的生产的制品减少了80%。
     3.1.4 高纯度白蛋白的制备[3] More解释了制备高纯度白蛋白的原因:常规用低温乙醇法大规模工业生产的从人血浆白蛋白虽已有良好的安全性和临床有效性,所制备的白蛋白纯度、人血清白蛋白达到95%,而且乙醇组分Ⅴ配制的人血清白蛋白都能很好地耐受,但该制品内也有低水平输注白蛋白引起相关的特异性不良反应的物质。为了使人血清白蛋白制品相关的不良反应减少到最低程度,应有更高的纯度和白蛋白的单体制品。实验分析发现,常规乙醇法制备的白蛋白中相对的蛋白杂质有结合珠蛋白、血凝素、转铁蛋白、脂蛋白、GC球蛋白、变性白蛋白/聚合体、内毒素/PKA/铝,其中的一些成分引起白蛋白制品稳定性差或有发热反应。尽管如此,对临床应用来说,纯度又是“相对的”。现在血浆一体化分离过程是低温乙醇法与层析法的有机结合,并形成了制备高纯度白蛋白的生产工艺路线,世界上已有不少厂家运用一体化分离的例子,如澳大利亚CSL乙醇法组分Ⅱ+Ⅲ上清,经DEAESFF,CMSFF,Sephacyl S—200;BPL乙醇法组分Ⅴ,经DEAE SFF;巴西血液中心,乙醇法组分Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ上清,组分Ⅳ经DEAE SFF,Sephacyl s200。下面着重介绍Zenable公司采用KisterNitschmann方法分离组分Ⅴ,再经离子交换层析纯化白蛋白。高纯白蛋白生产过程如下:混合血浆去冷沉淀后经硅藻土处理,再经19%乙醇、pH585、-5℃分离得A+1(组分Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ)上清,于40%乙醇、pH585、-5℃分离得组分Ⅳ上清,40%乙醇、pH48、-8℃下收集组分Ⅴ,重溶组分Ⅴ,经透滤,调节溶液再经离子交换层析,最后配制成45%和20%的白蛋白。从重溶组分Ⅴ经离子交换层析到配制白蛋白仅用15h,使用后离子交换柱再生和平衡只需25h。离子交换层析纯化白蛋白符合或超过欧洲药典,具有更高的纯度,更高的白蛋白单体含量,改进了稳定性(使不稳定批次降低即没有白点或混浊),控制了内毒素,制品损失减少。Zenable公司白蛋白制品的特性为:白蛋白纯度>98%,高单体含量>95%,降低铝离子含量<25μg/L,降低内毒素含量(无不合格批次),无小白点,白蛋白颜色转变为绿色。纯白蛋白为清亮的,血浆白蛋白(乙醇法)为金褐色的,这是因为有颜色不纯物质如结合珠蛋白、血凝素、α2HS铜兰蛋白、转铁蛋白等。Zenable公司层析法纯化的白蛋白为绿色,是由于降低了有色不纯物质的水平,胆红素由巴氏消毒时氧化成胆绿素(绿色)。纯度的提高使原有白蛋白颜色发生外观变化,因而需要“再教育”使用者。
    3.2 免疫球蛋白类中的应用
    3.2.1 低温乙醇法+层析法 Teschner等[4]采用改良低温乙醇法制备FⅡ后,用两步离子交换层析法制备IVIg的工艺,其要点是:将FⅡ沉淀溶解后澄清过滤,加Tween80和TNBP至终浓度分别为10%和03%,于25℃下处理4h,灭活结束后,用S/D后的蛋白溶液上阳离子交换层析,使S/D及其它杂蛋白流穿柱,IgG组分则被吸附在柱上,然后采用提高洗脱液的pH的方法将柱上的IgG组分洗脱下来并收集,随后将洗脱下来的组分调pH至60后,直接上1根阴离子交换层析柱使组分直接流穿柱,而其它不纯物、IgA等被吸附,从而进一步提纯IgG,最后将收集的纯IgG经过除病毒及超滤浓缩等步骤,制成pH 43—49、含甘氨酸025mol/L的10%的IVIg溶液,除菌装瓶,于30—32℃放置21—22d进行终端灭活。该制品的理化特性和动物体内外试验证明其纯度极高、IgG分子保证很好的完整性、制品的有效性及安全性未发生改变[5]。
     3.2.2 辛酸层析法[6] 该工艺步骤大致如下:以低温乙醇法的FⅡ+Ⅲ沉淀为原料,采用一步辛酸沉淀去除其中的白蛋白、脂质和部份辛酸被沉淀除去,紧接着补加辛酸对制品的脂包膜病毒进行灭活,然后将灭活液澄清后先后通过两步层析Qsepharose FF、ANXsepharose FF,收集IgG峰后,作超滤处理。第一步层析用Sepharose FF强阴离子交换,使IgG流穿层析柱而杂蛋白被柱内凝胶吸附,在此步层析中所有可检测到的白蛋白、绝大部分IgA、一部分IgM和辛酸盐的大部分被结合在凝胶上;第二步弱阴离子Sepharose FF交换柱主要是结合剩余的IgM及其它污染物。两步层析使整个生产周期大大缩短,较传统工艺步骤减少,使制品的纯度有了很大提高,IgG的回收率也增加了50%左右,其制得的制品可室温贮存2年以上。因此达到了既提高制品质量又能提高收率的双重效果,实现了多年来血液制品企业所追求的目标。
    3.2.3 全层析生产静注人免疫球蛋白 以冰冻血浆为原料,用G25柱脱盐后,在pH 52时使IgG流穿DEAESepharose FF柱,随后将流穿液pH调至65,电导14ms,置于用相同的缓冲液平衡的DEAE/Arg(4∶ 1)的混合柱上,再将流穿的IgG组份吸附在CM柱上,用pH 90的01mol/L Gly缓冲液洗脱,收集洗脱峰超滤制成。该工艺制备的制品在室温下放置1年后各项目指标无显著改变[7]。
    3.3 凝血因子类制品制备的应用
    3.3.1 FⅧ的制备 1991年法国的Burnouf等[8]报道了使用阴离子交换剂DEAEFractogel TSK 650M(Merck)制备高纯度的FⅧ浓制剂方法:将冷沉淀抽提液经Al(OH)3吸附后再次冷沉淀,获得中纯度的FⅧ,接着用S/D法(25℃ 8h)灭活病毒,将灭活液吸附(1kg冷沉淀需该凝胶600ml)FⅧ后,先用015mol/L NaCl缓冲液洗涤,再提高离子浓度至025 mol/L进行洗脱(洗脱液配制后可除菌过滤、分装、冻干),此方法操作简单、方便。近年来,大多数公司已采用DEAESepharose FastFlow (GE公司)或DEAE650M凝胶(大有色谱)代替DEAEFractogel TSK 650M,特别是前者效果不错。另外,德国的Dengler等[9]采用SephacrylS400HR(GE公司),来去除制品中的TNBP、胆酸盐及其它残留的化学试剂和绝大部分的外源性杂蛋白,但得率较低(40%)。还有一些公司开发出用单抗亲和层析制备极高纯的FⅧ浓制剂。
     3.4 亲和层析分离微量蛋白 从前述介绍看出,已有许多方法可用来分离人血浆蛋白质,但多数较费时,得到的制品质量不一。亲和层析是一种用生物分子间所具的亲和力而设计的层析技术。亲和层析基本过程是先选择欲分离物的亲和对象,并把它和水不溶性载体结合(通常Sepharose 4B或 Sepharose CL6B),使成固相化装入层析柱(或批式吸附)。把欲分离的血浆作为流动相,在有利于配基固定相和欲分离物之间形成亲和络合物的条件下,流进亲和柱,此时血浆中只有能与配基形成专一亲和的成分被吸附,不能亲和的其它蛋白成分直接流出,然后用洗涤液洗去沾附在凝胶表面的非亲和吸附物,再用高盐液解吸而释放出亲和物,亲和凝胶用适当溶液充分洗涤,使其再生。由此可见,亲和层析一般可分为载体活化、配基偶联、亲和吸附和解吸再生等步骤;亲和层析的操作与其它层析技术相似,所不同的是需要准确地选择亲和物的配基和配基固相化载体及合理地选择层析条件。为研究血浆蛋白功能和提供有临床使用价值的微量蛋白成分的浓缩物,已使用许多亲和配基,如肝素亲和抗凝血酶Ⅲ、赖氨酸亲和纤维蛋白溶酶原、刀豆素A亲和α1抗胰蛋白酶、明胶亲和纤维结合蛋白、抗FⅧ∶ C单抗免疫亲和吸附FⅧ∶ C等。为了消除或减少因FⅧ浓缩物中外来蛋白的反复刺激而引起免疫功能紊乱的不良后果,上世纪80年代后期,已有用单克隆抗体免疫亲和层析法纯化得极高纯的FⅧ浓缩物,如Armour 的Monoclate 使用抗vWF的单克隆抗亲和层析柱,Baxter HemophilM使用抗 FⅧ∶ C单克隆抗亲和层析柱。HemophilM制备步骤是:原料冷沉淀,溶解后经优球蛋白沉淀后,去除污染的蛋白,澄清,取澄清液加03%Tween80和1%TritonX100于20℃灭活病毒;过抗FⅧ∶ C单克隆抗亲和层析柱,使FⅧ前凝固蛋白吸附于层析柱,洗净杂蛋白、Tween80和Tritonx100后,用40%乙二醇选择性洗脱FⅧ,加白蛋白稳定FⅧ∶ C,将含FⅧ∶ C的洗脱液通过QAE离子交换层析柱,让单克隆抗体通过QAE柱,并再次用洗涤层析柱去除乙二醇,Tween80和Tritonx100,除菌、分装和冻干;最终得到FⅧ浓缩物,比活性2 000IU/mg蛋白。
    3.5 去除血液制品中的内毒素及病毒内毒素又称热原,是一种含有脂肪A、糖类、蛋白的带负电的复合大分子物质。内毒素与阴离子交换介质,如Q或DEAE Sepharose Fast Flow 有较强的结合能力,因此可以在洗脱目标蛋白后,用高盐缓冲液或者(05—10)mol/L NaOH溶液去除。以前部分生产条件差的血液制品厂家应用这种方法,生产的制品,如白蛋白、IgG等,受热原污染后可采用上述凝胶装柱,用适当的缓冲液平衡后,将污染热原的制品流穿层析柱,把热原质吸附于柱上,这样就可将其分开。
    凝胶层析技术除了上述应用外,也能对制品中病毒的去除发挥作用。如在生产人血浆FⅧ的流程中,通过QSepharose和SPSepharose的2次离子交换步骤,既有助于FⅧ与介质的牢固结合,又有助于病毒清除,使污染物很容易被洗脱去除。现已证实QSepharose能去除IBR、VSV和脊髓灰质炎病毒(Polio viruses),而SPSepharose能去除IBR、VSV和Polio病毒与Parvo病毒。据报道在白蛋白的生产流程中使用Sephacryl S200凝胶过滤步骤,对HAV的去除作用达到>46log。
参考文献
     [1]凌云,姚金鑫.亲和层析法制备人血浆白蛋白[J].西南民族学院学报(自然科学版),2000,26(1): 67—71
     [2]Tananka K,Shigueoka EM,Sawaatani E .Purification of human albumin by the combination ofmethod of Cohn with liquid chromatography[J]. Bra J Med Biol Res,1998,31(11):1383—1388
     [3]刘文芳.世界血液制品市场及其发展动态[J].中国输血杂志,2001,14(6):392—394
     [4]Teschjer W,Butterweck HA,Auer W,et al.A new liquid,intravenous immunoglobulin product (IVIg 10%)highly purified by astateoftheart process[J]. Vox Sang,2007,92(1):42—55
     [5]Rcipert BM,IIas J,CarnewaC,et al.Fc function of a new intravenous immunoglobulinptoduct:IVIg 10% triple virally inactivated solution[J].Vox Sang,2006,91(3):256—263
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     [7]罗亮,李书津,初毅波,等.层析法静注丙球中试生产[C].成都:全国血液制品学术交流会议(2000年,成都)论文集,128—132
     [8]Burnouf T,BurnoufRadosevich M,Huart JJ,et al.A highly purified factor Ⅷ:concentrateprepared from cryoprecipitate by ionExchange chromatography[J]. Vox Sang,1991,60(1):8—15
     [9]Dengler T Stocker U, Kellner, et al. Method for isolating factors Ⅷ from plasma by gel filtration chromatography under group separationconditions. Vox Sang,1990,58(4):257—263

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药徒
发表于 2016-1-23 23:08:23 | 显示全部楼层
三十余家么?我在血液制品公司时,领导同事一直都是说二十余家
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药徒
 楼主| 发表于 2016-1-23 23:11:48 | 显示全部楼层
现在是20多  这个资料是以前的  不过血液制品在工艺方面进展缓慢
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药士
发表于 2016-1-24 00:17:01 | 显示全部楼层
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发表于 2016-2-18 10:16:39 | 显示全部楼层
谢谢分享!
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发表于 2016-2-19 23:43:02 | 显示全部楼层
合肥的同路被上海哪家公司收购了?
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药徒
 楼主| 发表于 2016-2-21 12:29:05 | 显示全部楼层
锦衣夜行 发表于 2016-2-19 23:43
合肥的同路被上海哪家公司收购了?

安徽同路被上海莱仕亿收购了。
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发表于 2016-3-4 15:43:43 | 显示全部楼层
老资料,谢谢楼主
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药徒
发表于 2017-2-4 10:58:21 | 显示全部楼层
学习了,感谢感谢!
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发表于 2017-4-23 11:15:17 | 显示全部楼层
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