硅胶柱层析的原理是什么？如何操作？ - 蒲公英 - 制药技术的传播者 GMP理论的实践者

今天我们较为详细地聊一聊分离纯化中常用的“硅胶柱层析”。

硅胶柱层析，也叫硅胶柱色谱法，是一种利用混合物中各组分在固定相（硅胶）与流动相（洗脱剂）之间的吸附能力差异，而达到分离目的的物理方法。

简单打个比方：就如同“游泳比赛”，泳池赛道（色谱柱：填满了硅胶的层析柱）；运动员（混合物样品：各种不同结构的化合物）；运动员的体能（流动相：不断向下流动的洗脱剂）；水产生的阻力（固定相吸附力：硅胶对分子的吸附作用）。体能好、游泳技能高（即：吸附力弱的化合物与硅胶作用弱）游得快，先达终点；反之体能差、游泳技能一般（即：吸附力强的化合物与硅胶作用强）游得慢，后达终点。就这样，不同的化合物就被分开。

基于吸附色谱，即利用混合物中各组分在两种不相混溶的相（固定相和流动相）之间分配平衡的差异，从而实现分离。一般极性大的化合物与硅胶的吸附作用强，不容易被洗脱下来，在柱中移动得慢；极性小的化合物与硅胶吸附作用弱，容易被溶剂洗脱下来，移动得快。从而实现按极性从小到大依次被洗脱分离。

固定相：硅胶（SiO2·xH2O），它是一种多孔性物质，表面含有大量的硅羟基（-Si-OH），这些基团具有极性，能够通过氢键、偶极-偶极相互作用、范德华力等吸附其他极性分子。

一般极性小的用乙酸乙酯-石油醚体系，极性较大的用甲醇-二氯甲烷体系；具体也可以根据洗脱剂极性大小（以下面顺序递增）：正己烷<石油醚<环己烷<甲苯<二氯甲烷<乙酸乙酯<丙酮<甲醇<水<乙酸，进行组合调整得到想要的极性流动相。

一般拌样硅胶选用60-80目硅胶，样品与硅胶的比例控制在1:1~1:1.5，具体可以根据样品的分离难度与样品在溶剂中的溶解度进行适当调整，确保样品能完全吸附在硅胶上。

根据待分离样品的重量，称取相应比例重量的硅胶。一般用200-300目硅胶做填料，其用量是样品的5~50倍，当然也可以根据分离目的与难度调整填料的用量。选择合适的容器，首先装入硅胶体积约1倍量的装柱溶剂，再缓慢加入硅胶，用棒沿着一个方向充分的搅拌，使其硅胶完全浸润在洗脱剂中，同时排除浆液中空气，并释放出浆液中的热量。如果样品中待分离化合物用洗脱剂展板，其目标斑点的Rf值是0.2，那么用装柱洗脱剂展板，其目标斑点的Rf值应≤0.1。当然也可以选择洗脱剂中极性小的单一试剂做为装柱溶剂。

举例，如果洗脱剂是石油醚-乙酸乙酯-丙酮体系，就用石油醚做为装柱溶剂，如果洗脱剂是二氯甲烷-醇体系，就用二氯甲烷做为装柱溶剂。另外需根据样品TLC展板的情况，控制匀浆中的含水量，如果TLC展开剂中不能有水，必须预先用无水硫酸钠脱去洗脱剂中的水分，甚至还需对硅胶进行预先干燥处理。

将制好的匀浆液，一次性或快速、连续地倒入下端含有液位高约1~5cm装柱溶剂的色谱柱中。若柱层析管用的是无筛板玻璃柱，得用棉花将柱底塞紧（棉花一定不能塞的过厚，以免后期影响洗脱的流速）。注入匀浆后，同时打开柱下端活塞，让装柱溶剂流出，硅胶颗粒则在重力或压力下均匀沉降。同时对层析管进行敲打震动，使其沉降均匀无气泡。若为中压色谱柱，则用泵将装柱溶剂不断的泵入柱内（常用柱可以用加液球或气压泵加压），直至下端流速恒定，一般柱内填料约被压缩至9/10的体积。该过程一定要确保柱内的填料面不被扰动，保持平整。

在填料界面上方预留一定高度的装柱溶剂（液面高度一般取决于上样量的多少与填料界面上方的剩余柱高，最佳液面高度为上完样后预留液体液面高度约0.5cm），慢慢将干燥好的硅胶拌样物加入柱内。待上完样后，在上样层界面上方加入一层3-5cm高度的60-80目硅胶，再放入一层脱脂棉，用重物（干净的玻璃瓶盖、砂芯筛板等）压实，再慢慢加入一些装柱溶剂，使其完全浸入试剂中后，即可快速加入大量洗脱剂，而不会冲坏硅胶界面的平整。

柱层析要考虑分子扩散效应与分离度之间的权衡（及控制流速和洗脱剂的强度）。首先往柱子里加足量洗脱剂，液面高度保持10cm以上，若为常压柱，可在柱顶盖个小漏斗防止试剂挥发。控制流速，一般2-3BV/h（太快了组分分不开，太慢了耗时间），用下端活塞调节流速大小。控制洗脱剂强度，洗脱强度太低会导致洗脱效果不好（即目标点用洗脱剂展开的Rf值过小），一般单一目标点采用其Rf值约0.2的洗脱剂进行洗脱，多个目标点采用梯度洗脱。洗脱液收集一般用TLC分析判断，每份收集量一般采用方式：杂质斑点段用大瓶收集，快速通过；目标斑点段（即目标成分快出来时与目标成分快结束时）换用小瓶密集收集，一般用试剂瓶，每瓶接200-500mL（根据柱子大小定），做好标记，并根据TLC检测分析纯度。

2.根据TLC确定的洗脱体系，是否全程控水很关键：若含水影响分离，那硅胶、样品、溶剂都必须保持干燥，水分会严重破坏硅胶的吸附活性；反之若含水有利于分离，就不必过于控水。

3.确保选择的柱层析洗脱剂对样品具有较好的溶解性，避免样品在洗脱过程中在柱内析晶。

4.在未完全确定所有目标物之前，不要轻易丢弃任何接收瓶中的液体，不要处理硅胶柱，以防产品损失。

5.根据分离的目的选择硅胶规格与洗脱剂的极性：分离难度大、斑点接近选用细硅胶（200-300目），简单分离可用较粗硅胶（60-80目）以加快流速。

6.用完的溶剂桶及时盖好，存放在安全处。尽可能的控制柱层析过程中试剂挥发到操作环境，做到安全第一。

硅胶柱层析‌适用分离中等极性至非极性的有机小分子化合物，如大多数天然产物、生物碱、黄酮类、苷类、有机酸、甾体、芳香族化合物等天然活性成分以及难以通过结晶分离的合成中间体。硅胶柱层析作为分离纯化领域的经典技术，其精妙原理及严谨操作，共同铸就了高效精准的分离效果。

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