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[蒲公英大讲堂] 【知药学社】腺病毒载体规模化制备与纯化要点分析

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大师
发表于 2019-3-4 14:02:44 | 显示全部楼层 |阅读模式

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本帖最后由 imqk 于 2019-3-4 14:42 编辑

编者按:本文为知药学社社员刘波在知药学社社群分享的课程,知药学社将进一步加大对生物制品、无菌制剂等方面的内容分享,有相关课题分享意愿的老师可直接联系我,公益分享传播知识同时,通过知药学社平台可以让更多人认识你,关注你们公司产品,实现多赢。
本文分享者:刘 波     来 源:知药学社

一、腺病毒载体的历史背景及发展近况
基因治疗名词解释:通过载体将正常的基因导入到有基因缺陷的细胞里,使细胞恢复到正常状态,从而达到治疗疾病的目的。

基因治疗作为一种治疗疑难疾病的医疗手段,自上世纪80年代问世以来,不断发展至今,逐渐受到人们的重视和青睐,近两年更是频频进入大家的视野。

用于基因治疗的载体可分为病毒载体与非病毒载体。病毒载体中,最为常用的有腺病毒载体、慢病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体等等。下面给大家介绍的就是腺病毒载体。

我国目前已上市的腺病毒载体药物有两种:
1、今又生-重组人P53腺病毒注射液(深圳赛百诺)
2、安柯瑞-重组人5型腺病毒注射液(上海三维)

CDE网站上临床试验中腺病毒载体新药:
1.jpg

二、腺病毒载体的获得及培养
1、腺病毒载体的获得方式:
2.jpg

2、腺病毒的培养
I、小、中规模培养
3.jpg

培养要点:细胞培养时的良好的细胞状态固然重要,但两者更需要把握的关键还有染毒前的细胞均匀度与汇合度。均匀铺展的85%~90%汇合率细胞,能很好提高病毒产率。

II、大规模培养
生物反应器培养方式适用于生产规模,可分为以下三种:
1)贴壁培养  
4.jpg
该培养方式目前仍属于主流。但这种方式需要使用血清,在未来几年可能会受到药监部门政策的限制,腺病毒的生产将不允许添加血清,所以行业都在向无血清培养方式转变。

生物反应器贴壁培养要点:
胞培养阶段
填充物用量:填充体积一般占反应器总体积的25%~40%
细胞接种量: 1~2E4 Cell/cm2
搅拌桨转速: 60rpm~130rpm
溶氧: 30%-60%
pH7.20~7.40
培养基置换:以培养基中葡萄糖浓度为监控指标, 流加培养基使用葡萄糖浓度维持在0.5~2g/L,培养后期可降低血清浓度。

完成培养指标:根据糖耗推算细胞数,达到填充物面积的85~90%汇合率时,完成细胞培养,可接种腺病毒。

②病毒培养阶段
病毒接种量:过多导致细胞死亡过快, 过少则影响病毒收获时期

培养基置换:接毒前应将反应器内培养基全部置换,将降低血清浓度。接毒后4~7小时才可流加,补充营养与避免毒种流失。

上清病毒收获:每日监测培养上清中病毒含量,出毒后即收获病毒上清。准备收获病毒上清前,可将流加培养基中的血清浓度降到0%
以降低后续纯化工序的负担。

胞内病毒收获:培养基中葡萄糖消耗量下降到30-40%,即可终止培养,裂解细胞释放病毒

2)悬浮培养方式
5.jpg

病毒培养阶段
病毒接种量:与贴壁培养同理,但可以适当提高病毒接种量。

培养基补加:与贴壁培养不同,不能将反应器内培养基全部置换,接毒后需立即补加一定量的培养基维持营养,待病毒完成感染后再开始进行流加置换培养基;若在细胞培养阶段是用的批次流加,则病毒培养阶段仍采用此策略。

病毒收获:一般在感染病毒48-72小时后即可终止培养,收获细胞并裂解释放病毒;若培养上清中病毒含量较多,也可将上清收集一同送入纯化工序。

3)贴壁培养+悬浮培养
6.jpg
三、腺病毒纯化

I、病毒纯化之样品前处理

1、目的:去除样品中的大颗粒及小分子杂质,并将样品浓缩并置换到层析缓冲液相近的条件。
2、方法:大颗粒杂质主要是宿主细胞碎片,可用离心和过滤的方法去除。小分子杂质主要是宿主细胞的DNA及蛋白质,可先用核酸酶将DNA消化,再用超滤的方法将其滤除。样品浓缩和置换缓冲液在超滤时同步进行。

3、样品前处理要点:

去除大颗粒杂质时,过高速离心或超压过滤时,会造成病毒损失,要控制好离心转速并且匹配好料液与滤膜面积的关系。

去除小分子杂质时,要注意超滤膜孔径(分子量)的选择,分子量过小导致杂质去除率低;分子量过大导致病毒损失。一般选择病毒直径1/3左右的膜孔径。超滤操作过程中还需要控制好进样压力和液流中气泡,避免损伤病毒的附属器导致病毒失活。

浓缩及置换缓冲液时,因液体湍流作用会再次产生一些肉眼可见的杂质,应在上层析柱前离心或过滤去除

II、病毒纯化之柱层析

1、通常采用两步层析法可获得高纯度的腺病毒
强阴离子凝胶(Q sepharose XL+高分辨阴离子凝胶(source 30Q
强阴离子凝胶(Q sepharose XL+分子筛凝胶(Sepharose 4 FF
强阴离子凝胶(Q sepharose HP+复合型凝胶( Capto core 700

2、柱层析要点
上样量:不同层析填料、不同的样品处理,会有不同的特异性载量,通过小试积累数据评估出特异性载量,再进行放大。

上样流速:控制流速,使病毒样品在层析填料中保留15分钟以上。
起始盐浓度:适当提高样品及平衡缓冲液的盐浓度,可提高收率、缩短时间。

层析填料清洗:常规的再生方法并不能很好地清除杂质残留,累积至一定量时会影响纯化效率,需要用变性剂对填料进行彻底清洗。

III、病毒纯化之浓缩与置换

1、目的:提高病毒浓度、降低盐浓度

2、方法:用超滤方法将病毒浓缩至预期的浓度。通过10-20倍超滤置换,将病毒置换到最终制剂缓冲液中。

3、病毒浓度:过高的浓度容易导致病毒聚集成团,不可过度浓缩。

4、超滤膜分子量(孔径)的选择:可选择更小孔径的超滤膜提高病毒回收率。超滤操作过程中还需要控制好进样压力和液流中气泡,避免损伤病毒的附属器导致病毒失活。

    
Q:无血清培养效果如何,能完全代替血清吗?后期维持液是在什么时候换成无牛血清培养基?残牛含量能控制到什么水平?

A:如果是贴壁的培养方式,在细胞培养阶段是不能够完全用没有血清的培养基去培养,只是可以降低培养基的浓度,比如从10%降到2%。如果是无血清悬浮培养的方式,就现在我们用的,筛选出有好几种国产的无血清培养基,培养的效果都是比较好的。如果是贴壁培养,前期用的是含血清培养,然后再接毒的时候换成不含血清的培养基,在后期产品血清残留可以控制到几个纳克每毫升。

Q:酶切的方法现在是否是允许的?
A:酶切的方法现在是允许的。根据中检院老师发布的一些生物制品的控制原则,里面是可以用酶来生产,但在后期需增加酶残留量的检测。

Q:连续灌流现在做到多大规模?
A:如果是无血清悬浮培养,国内水平基本的都是WAVE反应器,几升到上百升的规模,国外水平会比较高一些。

Q:生物制品的复杂性决定了其制备的不确定性,纯化后目标物质有时浓度不够,有时浓度会很高,工艺上是规定再浓缩还是不再浓缩?不规定,浓度不够时再浓缩,可能会导致发生在长生身上的问题,这个在做工艺时如何去规定?
A:这个问题,我们处理方式是从精纯这步开始解决。在粗纯后测定产物浓度,再上精纯,出来的产物浓度就可以控制在一定范围之内,后续工艺全部都写需要浓缩。

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药士
发表于 2019-3-4 15:37:42 | 显示全部楼层
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药徒
发表于 2019-3-5 11:07:11 | 显示全部楼层
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药生
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