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[药理毒理] 中药抗氧化的作用机理及药物筛选模型建立研究

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发表于 4 天前 | 显示全部楼层 |阅读模式

中药的抗氧化作用由来已久,其中的抗氧化成分可以清除人体内自由基还原氧化物质,从而达到保护机体的作用。建立抗氧化药物筛选模型,为从中草药中筛选具有抗氧化和清除自由基活性的物质,对医药研发具有重要的意义。

建立一种高效、简便、高度敏感的高通量抗氧化药物筛选模型,可应用于抗氧化候选药物的初步筛选研究。针对特定的要求和目的通过建立合适的药物筛选模型能缩短研发周期,降低研发成本。美迪西生物医药在抗肿瘤、免疫性疾病、抗炎、心血管疾病、镇痛和糖尿病等研究领域建立了相对成熟的药物筛选模型,既包括微量、快速、高自动化的新型高通量初筛模型,又包括深入筛选的各级复筛模型,形成了高效、多层次的新药筛选平台。

1、中药抗氧化作用机理

人体的衰老过程除了与遗传有关外,也与机体内外环境中的不利因素造成机体成份,如DNA、蛋白质和脂类的损伤有关。目前认为中药成分对机体氧化损伤的保护作用主要有以下几个方面。

(1)清除活性氧自由基

自由基又叫游离基活性氧,自由基是一些处于激发态的含氧基团如超氧阴离子自由基、羟基自由基、烷氧基自由基等。自由基是化学性质最活泼的活性氧,它带有的一个不成对电子是对人体毒性最大的自由基。它可以与活细胞中的任何分子发生反应而造成损害而且反应速度极快。自由基引起机体中毒的主要原因可使核酸链断裂、多糖解聚和不饱和脂肪酸过氧化进而造成膜损伤、线粒体氧化磷酸化等影响。

(2)增强抗氧化酶活性

细胞在生命活动过程内不断地产生自由基机体的抗氧化酶通过一系列的催化反应将其转化为O2和CO2。细胞中的主要抗氧化酶是超氧化物歧化酶SOD谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px和过氧化氢酶CAT。

SOD是含有Cu、Zn、Mn、Fe等金属离子是体内超氧阴离子的主要清除者将其催化分解为H2O2,H2O2也具有氧化损伤作用通过过氧化氢酶将其转化为O2和H2O。同时H2O2也可通过GSH-Px的催化和还原型谷胱甘肽GSH反应生成H2O同时生成还原型谷胱甘肽。

(3)抗脂质过氧化,维持细胞膜稳定性

细胞中自由基对细胞的直接损伤作用主要是攻击细胞膜上的脂质,自由基先和细胞膜上的磷脂或低密度脂蛋白LDL的不饱和脂肪酸反应,该反应产物又攻击附近的不饱和脂肪酸最终导致链式反应的产生。
(4)减少DNA损伤

自由基学说认为过剩的自由基可以攻击DNA引起DNA损伤从而引发多种疾病。对中药抗氧化作用的研究目前在某些方面已深入到DNA分子水平。
(5)对氧化酶系活力及表达的影响

如对黄嘌呤氧化酶XO的影响,XO可将黄嘌呤催化生成尿酸盐同该过程是缺血/再灌注损伤的一个非常重要的途径。在机体正常生理状态下该酶以黄嘌呤脱氢酶形式存在,在机体处于缺血状态时黄嘌呤脱氢酶转化为XO,当缺血组织再灌注时XO催化产生超氧阴离子导致氧化损伤。因此黄嘌呤氧化酶的含量可作为抗氧化研究的指标成分。
    另外对一氧化氮及一氧化氮合酶的影响。正常生理状态下NO在舒张血管内皮、维持机体血压平衡方面起重要作用。但高浓度却能和活性氧反应后产生氧化能力更高的亚硝基自由基,同时NO也可看作是一种自由基导致细胞氧化损伤。在缺血再灌注损伤时NO主要合成酶诱导型一氧化氮合酶iNOS活性增加大量NO产生而导致氧化损伤形成。

Keapl-Nrf2-ARE信号通路调节机体内多种抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶的表达,在氧化应激反应中起着重要作用。因此利用抗氧化反应元件ARE调控荧光素酶报告基因的表达水平,可建立抗氧化药物筛选模型。

2、抗氧化药物筛选模型的建立

构建由ARE调控荧光素酶报告基因表达的重组质粒载体pARE-Luc-Neo。采用MTT法评价G418对Hek293的毒性作用,确定G418最佳筛选浓度为800μg/mL。使用FuGENE HD转染试剂将pARE-Luc-Neo转染Hek293细胞(人胚肾上皮细胞)。转染24h后,通过G418筛选,稀释法挑选阳性单克隆细胞株,获得26株单克隆细胞株。单克隆细胞株经Ⅱ相解毒酶诱导剂TBHQ诱导筛选,检测细胞中荧光素酶的活性,获得荧光素酶高表达细胞株Hek293-ARE。

利用TBHQ、白藜芦醇、姜黄素和穿心莲内酯评价Hek293-ARE的筛选效果,结果表明TBHQ、白藜芦醇、姜黄素和穿心莲内酯对Hek293-ARE细胞中荧光素酶的表达具有良好的诱导效果,且在一定范围内与诱导剂浓度呈剂量效应关系。从遗传稳定性和表达稳定性两方面验证细胞模型的稳定性,结果表明细胞模型稳定性良好,经过以上验证表明成功建立了抗氧化药物细胞筛选模型,Hek293-ARE细胞可用于抗氧化药物的初步筛选。

3、抗氧化药物筛选模型用于药物的筛选研究

将细胞模型应用于对现有的18种中药单体的筛选,结果表明中药单体熊果酸、隐丹参酮、黄连素、水飞蓟素、芹菜素、染料木素、灯盏花素、黄芩苷、大豆苷元、汉黄芩素、大黄素和大黄酸对Hek293-ARE细胞中荧光素酶的表达有良好的诱导效果,并在一定范围内具有明显的剂量效应关系,提示这12种中药单体可能通过激活Keap1-Nrf2-ARE信号通路发挥其抗炎、抗氧化等作用。

对蛹虫草粗多糖的筛选结果表明,蛹虫草粗多糖对Hek293-ARE细胞中荧光素酶的表达有良好的诱导效果,并在一定范围内具有明显的效应剂量关系,提示蛹虫草粗多糖能够诱导抗氧化酶和ΙΙ相解毒酶的表达而起到抗氧化的作用。

对蛹虫草水提组分的筛选结果表明,2#、3#、4#、7#、11#、12#和14#样品对Hek293-ARE细胞中荧光素酶的表达有良好的诱导效果,提示这些组分可激活Keap1-Nrf2-ARE信号通路,从而可能具有抗氧化的作用。

抗氧化药物筛选细胞模型成功的建立为发现新型抗氧化药物,从天然药物中大规模快速筛选具有抗氧化作用的活性成分,提供了先进、有效、高通量的筛选途径,并对抗氧化药物作用机制的研究具有重要意义。


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