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[生物制剂] 大脑多巴胺神经营养因子在杆状病毒载体表达系统上的表达研究

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药徒
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发表于 2019-1-11 09:06:45 | 只看该作者 回帖奖励 |倒序浏览 |阅读模式

对于常规小量及高纯度的蛋白质生产而言,利用体外培养的昆虫细胞来进行表达是首选途径,甘氨酸和半胱氨酸营养缺陷型的Sf9是目前应用较为广泛的昆虫细胞。氨基酸缺陷型培养基可以用于重组蛋白的结构研究,氨基酸影响缺陷型可以用于遗传学分子、微生物代谢途径的研究及细胞和分子水平基因重组研究。在大鼠帕金森病动物模型中,大脑多巴胺神经营养因子CDNF是一种潜在的能够保护和恢复多巴胺能神经元的功能的关键治疗蛋白。CDNF在包括大脑皮层,海马,黑质,纹状体和中脑等多个脑区的神经元中广泛表达,有研究者应用bac-to-bac杆状病毒载体表达体系在sf9昆虫细胞中表达重组CDNF蛋白。

应用杆状病毒载体表达载体,昆虫培养细胞作为宿主的真核表达系统已被广泛应用于生产外源蛋白质,特别是成功表达了大量的具有很高医药价值的活性蛋白质之后,备受人们青睐。要让细胞很好地生长和繁殖,必须努力创造合适的条件,最好模拟细胞原来生长的体内环境,包括温度、PH值、渗透压和氧气供应情况。细胞体外培养需要合适的培养瓶或者特定的培养界面,但是细胞培养中较为关键的因素是培养基。美迪西提供一系列氨基酸缺陷型培养基,包括甲硫氨酸缺失、苯丙氨酸缺失等,用于重组蛋白的标记及结构研究。培养基为液体无血清培养基,在昆虫细胞的基础培养基上根据要求缺失相应的氨基酸。

无血清培养基与胎牛血清(FBS)培养基相比,具有化学成分明确、培养条件容易控制、减少了不同批次培养基之间的数量和质量上的差异等优点,同时无血清培养基还可以除去微生物污染的潜在来源,和有利于细胞培养产物的分离等下游的操作。无血清培养基的使用在全世界范围内减少了FBS的用量,从而减少牺牲胎牛的数目,因此基于无血清的氨基酸缺陷型培养基具有很多优点。

应用bac-to-bac杆状病毒载体表达系统在sf9昆虫细胞中表达重组CDNF蛋白。方法是应用Trizol法提取小鼠组织总RNA,RT-PCR扩增得到小鼠CDNF基因全长(564bp)片段,将CDNF基因插入至转座载体pFastBacHTb中。构建重组质粒pFastBacHTb-CDNF,然后转化到E.coli DH5α感受态细胞中,以LB/Amp平板筛选阳性重组子,并经PCR、酶切及测序验证以保证重组载体的正确及可靠性;

将杆状病毒转移载体pFasBacHTb-CDNF转化到DH10Bac E.coli(自带杆粒及辅助质粒)感受态细胞中,通过转座作用将目的片段整合到杆粒中,抗性及蓝白斑筛选法筛选出重组杆状病毒载体Bacmid-CDNF,使用CDNF特异引物及PUC/M13杆粒测序引物对重组杆粒进行验证;参照CELLFECTINⅡ脂质体转染剂操作说明,将重组Bacmid-CDNF杆粒转染sf9昆虫细胞,并在光学显微镜下观察细胞形态学变化,以判断转染的成功性;转染成功后,收集P1代病毒液,继续感染sf9细胞,可获取P2代和P3代病毒液,应用P3代病毒诱导重组CDNF蛋白的表达,并应用Western blot对重组蛋白的表达进行验证。

结果发现:

(1)RT-PCR结果经琼脂糖凝胶电泳显示,成功获取564bp大小的CDNF目的基因片段,重组质粒pFastBacHTb-CDNF经PCR、酶切及基因测序验证均正确无误;

(2)重组转移载体pFastBacHTb-CDNF转化DH10Bac感受态细胞后,阳性bacmid-CDNF重组子经CDNF特异引物及pUC/M13杆粒测序引物PCR验证可分别获取561bp及3000bp大小目的片段,均与理论大小相符,表明杆粒构建成功;

(3)重组杆粒通过Cellfectin转染剂转染sf9昆虫细胞,转染48~72后,sf9细胞细胞直径逐渐增大,细胞渐脱离贴壁培养状态,随之,细胞渐渐肿胀,种种迹象均表明,杆粒转染成功,收获杆状病毒液;

(4)P3代杆状病毒液感染sf9细胞,诱导重组CDNF蛋白表达,经Westernblot验证,目的蛋白成功诱导表达,并符合预计大小(21KD)。 因此通过bac-to-bac杆状病毒表达系统成功诱导CDNF重组蛋白的表达。

Bac-to-Bac杆状病毒载体表达系统可以提供快速有效的方法产生重组杆状病毒,使用这个系统产生重组杆状病毒较传统的同源重组具有:与使用同源重组产生重组杆状病毒所需的4-6周相比,鉴别纯化重组病毒少于两周;减少了从斑点筛选重组病毒DNA所包含亲缘和非重组病毒的几率;可以快速同时进行大量重组,适合表达功能性研究的蛋白的优点。将Bac-to-Bac杆状病毒载体表达系统应用于重组大脑多巴胺神经营养因子的研究,为研究该蛋白的功能研究提供了研究基础。


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药徒
沙发
发表于 2019-1-11 12:51:21 | 只看该作者
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