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引言 在生物体内,通过糖基转移酶和糖苷酶等活性酶的作用,可以进行糖基的附着和去除。这些酶所产生的分子在生物体中有许多重要的作用,如细胞通讯,结构支持和能量代谢等。一般来说,每一类糖的转化都需要特定酶的催化,因此酶的种类非常多样化。而高通量方法因为可以一次监测多种酶,使得这种多样性的管理成为可能。同时,高通量方法筛选商用化合物库也是寻找调节酶活抑制剂的有效途径。文章作者概述并讨论了利用高通量方法实现这类具有挑战性的糖类研究新进展。 背景 生物制剂是一种发展非常迅速的药物类别,但它们的糖基化状态对活性有很大的影响,因此能够将糖链改造为最佳状态的酶具有非常高的需求。同时,随着糖活性酶在合成中作用的增加,改良以及发现催化酶来扩大合成反应的范围变得越来越重要。例如,自然界的多聚糖在用于生物质转化时,往往需要糖活性酶来促进其向碳氢化合物转变。 利用传统的糖活性酶学方法已经取得一定的成功,例如利用过渡态模拟方法实现糖苷酶的抑制,而一些糖基转移酶抑制剂也已经应用于临床,这也说明了它们作为靶点的重要性。但是由于对酶的作用机制及其结构了解的欠缺,使得传统方法的发展依旧缓慢;另外传统方法在特异性选择方面也存在一定的困难。 而过去的几十年间,高通量技术的发展推动着糖活性酶学经历着一场革命。同时许多用于检测抑制剂作用的方法可以用于检测活性的提高或者改良现有酶,调整最佳反应条件或发现全新的酶。采用新技术发现与改良获得的抑制剂和酶,不仅可以优化作用效果,更是能开发出新的作用模式/催化反应。因此开发不需要大量作用机制等背景知识,并且能精确靶向特定酶的方法,将开辟糖类研究的新道路。
本文作者概述了如何使用诸如高通量化合物库筛选、(糖)肽的噬菌体/mRNA显示、荧光激活细胞分选和宏基因组学等技术来寻找这些酶和抑制剂。 发现抑制剂 高通量筛选化合物库寻找抑制剂的核心在于酶活性信息的获得方法。糖苷酶的活性通常可以将底物与荧光信号联系在一起,利用这种方法对类药化合物库或天然产物库进行高通量筛选。最近发现了几种糖苷酶抑制剂的替代策略,如人胰腺α-淀粉酶的两种不同抑制剂。一个是海洋来源的蛋白质--Helianthamide,因为与酶活性点位非常紧密的形状互补表现出很好的抑制活性。而另一种是植物来源的糖基化黄酮醇--MontbretinA(图2A)则通过与糖苷酶的催化残基发生相互作用,从而展现出一种新的抑制方式。 而糖基转移酶的情况更为复杂,往往需要使用间接或偶联分析,需要通过检测NDP或NMP的产生来进行信号的读出。然而在某些条件下,例如对粗裂解物的测试这些方法可能会遇到困难。一种基于底物亲和力的方法提供了另一种选择,它是使用抑制剂取代标记底物产生的荧光极化变化来进行检测。其中Walker小组就从Chemdiv的化合物库里,成功筛选得到具有微摩尔级别EC50的苗头化合物OSMI-4,可以用于抑制O-GlcNAc转移酶。
肽的噬菌体/mRNA显示法,原则上可以筛选任何与糖活性酶/糖结合蛋白有很强亲和力的肽,从而发现基于肽链的抑制剂。但同时这种基于亲和力的方法只选择与目标酶结合的肽,对于酶活性需要进一步的研究。mRNA比噬菌体显示在寻找抑制剂方面有几个优势,一方面它不需要任何体内操作来限制通量或肽序列空间,另一方面它更容易进行化学修饰。大环肽淀粉酶抑制剂piHA-Dm(Y3d)的筛选正是证明了这一观点。由于这种方法完全是在体外进行的,因此更易于进行遗传代码重编程和翻译后修饰,扩大了可以探索的化学空间,并允许在发现阶段直接加入稳定的大环或氮甲基等元素。 这个方法也适用于筛选糖结合蛋白的抑制剂。噬菌体显示方法筛选出的血凝素结合肽,能够以低纳摩尔亲和力与H1和H3结合。其硬脂酰衍生物C18-52(1-5)也被证明是可以有效预防MDCK细胞造成的流感。参与血凝素结合的关键肽残基为两个精氨酸和一个亮氨酸,这些带正电的氨基酸与一个带负电的糖的结合位点相结合。同样,噬菌体显示法也发现了与霍乱毒素B结合的肽序列,这些多肽还能够阻止毒素在细胞上的吸附和通过cAMP水平测量的细胞内信号转导。这些说明了可用于多聚糖结合位点的结合模式的多样性,并增加了预测这种高通量方法结果的难度。 而使用噬菌体/mRNA显示技术来发现糖肽是最近几年才兴起的研究。糖部分可以直接结合到位点上,而肽序列部分可以提供额外的亲和力和选择性。Krauss小组利用mRNA显示筛选得到一个糖肽10F2,以一种类似天然的高效作用模式与抗体结合。 另外,文中作者还提及了酶的改良与发现相关的研究内容,感兴趣的小伙伴可以下载文献学习一下~说不定对发现新的糖活性酶有帮助哦~
总结 高通量方法正在推动糖科学在许多方面获得新发现。在寻找抑制剂的过程中,基于孔板的化合物库筛选,噬菌体显示肽或小蛋白等成熟的技术已经证明了它们的价值。随着通量的增加以及可访问化学空间的扩大,具有更高亲和力和选择性的苗头化合物能够筛选到。同时例如偶联分析和产物捕获等筛选方法的陆续被报道,使得所需的活性信息以更高的灵敏度,通量和鉴别能力获得。 随着通量和筛选技术的发展,可以更加快速高效地筛选大量化合物,从而加快调节剂/药物发现的速度,这个过程离不开优质的高通量筛选化合物库供应。陶术生物作为Chemdiv在中国的独家代理,能够提供多种类型的Chemdiv化合物库,帮助您更顺利地进行高通量筛选工作。欢迎关注陶术生物 药物筛选一站式平台获取更多内容。
参考文献: Lemeng Chao and Seino A. K. Jongkees. High Throughput Approaches in Carbohydrate-Active Enzymology: Glycosidaseand Glycosyl Transferase Inhibitors, Evolution, and Discovery. Angew. Chem. Int. Ed.10.1002/anie.201900055
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