【转载】合成首尾环肽的方法

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合成首尾相连环肽的经典方法是在稀溶液（10-3～10-4M） 中，将保护的线性前体选择性地活化并环合。常用活泼酯法和迭氮法。
1.1 活泼酯法
活泼酯法中活化羧基和环合反应是分两步进行的。活泼酯相对很稳定，一般不需要纯化可直接用于环合反应。几乎所有可用于偶联反应的活泼酯都可用于合成环肽，主要有对硝基酚酯、N-羟基琥珀酰亚胺酯、五氟苯酯和2，4，5-三氯苯酚酯。线性多肽的C端羧基与对硝基酚、N-羟基琥珀酰亚胺、五氟苯酚或2，4，5-三氯苯酚，在DCC或其他缩合剂存在下，于低温反应，很容易得到相应的活泼酯。这种N端通常带有BOC或Z保护的活泼酯在酸性条件下脱去保护基，形成活泼酯的氢卤酸盐，在弱碱性稀溶液中，如在吡啶，DMF或二氧六环一类介电常数较大的溶剂中，保持pH8～9，加热（60～100℃）或室温搅拌数小时至数日，最终可得到环肽。
1.1.1对硝基酚酯法：
对硝基酚酯法合成环肽的通式如Scheme 1

Cyclo（b-Ala-Phe-Pro）的合成中应用了对硝基酚酯法。Boc-b-Ala-Phe-Pro-OH在乙酸乙酯中与1.5摩尔量对硝基酚混合，DCC为缩合剂，得到Boc-b-Ala-Phe-Pro-ONp，经TFA脱去Boc，以0.1M NaHCO3和0.1M Na2CO3为碱，二氧六环为溶剂，室温反应，得到收率为32% 的环三肽。对硝基酚酯法的优点在于对硝基酚价廉易得，缺点是过量的对硝基酚不易完全除去，产物不易纯化，颜色发黄。
1.1.2 N-羟基琥珀酰亚胺酯法：
该方法原理与对硝基酚法一致，唯一不同点在于线性多肽的C端羧基在缩合剂EDC的存在下与N-羟基琥珀酰亚胺（HONSu）缩合，形成直链多肽的N-羟基琥珀酰亚胺酯。应用这种方法Toshihisa等在吡啶溶液中合成了cyclo（Pro-Val-Pro-Val）和cyclo（Pro-D-Val-Pro-D-Val），收率分别为15%和12%。二者为非对映异构体，前者具有植物生长抑制作用，后者却表现为植物生长促进作用。

1.1.3五氟苯酚酯法：
这类活泼酯用于环肽的合成是近年才发展起来的。Joullie在合成天然环肽生物碱Sanjoinine G1和其C11位对映异构体时在环合步骤中就应用了五氟苯酚酯法。首先以D-丝氨酸为原料，经多步反应得到环合前体，用五氟苯酚活化羧基，N端苄氧羰基经氢解脱掉后，以4-吡咯烷吡啶为催化剂，在二氧六环中回流，最终得到两个互为异构体的混合物，收率分别为27%和22%，环合步骤如下图：

另外，海洋生物环肽Patellamine B以及对纤维蛋白酶和丝氨酸蛋白酶有强烈抑制作用的环肽Cyclotheonamide A的环合步骤也是应用了五氟苯酯法，收率分别是20%和53%。
1.2 迭氮法

在多肽合成中迭氮法是另一种比较经典的方法，这种方法的优点在于很少引起消旋反应，最早用于直链肽的合成，现在常常被用于环肽的合成。具体方法是，把直链肽的甲酯、乙酯、苄酯，取代苄酯或其它更活泼的酯通过肼解的方式生成酰肼，溶于醋酸或盐酸-醋酸混合溶液，在-5℃左右的温度下加入1M的亚硝酸钠溶液，产生的亚硝酸则与酰肼反应生成迭氮物。N端游离的直链肽迭氮物于4℃ 搅拌一天再升温至室温，可得环肽。通式如Scheme 4。
Scheme 4. PeptideCyclization via the acyl azide（X=Z or Boc，R=Me，Et，Bzl）
Bodansky最早应用迭氮法合成了cyclo（D-Ala-D-Ala-Val-D-Leu-Ile），虽然上述环肽不具有其母体化合物malformin的生物活性，但合成它为应用迭氮法合成环肽开辟了前景。
应用迭氮法合成环肽的另一个成功的例子是内皮素拮抗剂的合成。Endothelin（ET）是一种高效的血管收缩剂，由21个氨基酸残基组成，其受体拮抗剂之一cyclo（D-Trp-D-Asp（OtBu）Fmoc-Ser-D-Val-Leu）的合成过程如下：

DPPA系二苯基磷酰基迭氮化物，是一种稳定的液体，沸点157℃，用二苯基磷酰氯和NaN3在丙酮中室温反应很方便地得到，可以直接用作多肽偶联的缩合剂，近年来多用于环肽的合成。
Arg-Gly-Asp（RGD）是多种细胞外蛋白与整合素相互作用时被整合素识别的关键序列，对含有该序列环肽的合成报道很多。Kessler等用固相合成仪SP650合成了13个含RGD序列的线性六肽和七个含RGD序列的线性五肽，N端和C端均游离的直链肽在稀溶液中以DPPA为缩合剂，保持pH 8.5～9，反应4天，得到相应的环六肽和环五肽，收率在15%～50%之间。生物活性实验表明所有的环六肽对细胞粘附的抑制作用均明显低于线性肽GRGDS。环五肽中也只有Cyclo（RGDdFV）和Cyclo（RGDFd-V）对Laminin P1的细胞粘附具有明显的抑制作用。
对于某些在碱性条件下易分解的目的物，反应过程当中应用惰性气体进行保护，例如，线性多肽H-Asp（Fmoc）- d-Ser-Phe- D-Phe- Arg- Gly - OH在无水DMF中，加入5倍量NaHCO3和10倍量DPPA，反应66小时，得到收率仅为3%的纤维蛋白原受体拮抗剂Cyclo（Asp-D-Ser- Phe-D-Phe-Arg-Gly）；若改变NaHCO3和DPPA用量，并且反应过程中用氩气保护，反应三天，可得到产率高达39%的上述环肽。两种条件下所得收率有如此大的差别，主要原因是目的物在碱性条件下易分解。
以DPPA为缩合剂合成环肽时，除了用NaHCO3、Na2CO3为无机碱外，也常使用KH2PO4。例如能够与鸦片受体结合的环肽Try-C[D-A2bu-Phe-Phe-（L or D）-Leu]的合成中，就使用了KH2PO4这样的弱碱催化，收率高达75%。用同样的方法合成Somatostatin的类似物Cyclo（Lys-Phe-D-Trp-Lys-Thy-Phe），收率也达到了42%。
以DPPA为缩合剂合成环肽时，有机碱常用三乙胺（Et3N）、N-甲基吗啉（NMM）和二异丙基乙胺（DIEA），这三种弱碱能够与有机溶剂混溶，用量远远少于NaHCO3和KH2PO4，而且NMM和DIEA不易引起消旋。

彩虹

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