qPCR试验中，上机读数前加样和混匀的疑惑

hangzhouhdjy

老师们好，最近刚接触qPCR的试验，遇到一些问题想请教一下。

在上机读数前，需要将提取到的DNA和qPCR MIX共同加入到八连排管/PCR板里，混匀离心后放入qPCR仪。疑问如下：
1、说明书里提到，在qPCR MIX的准备这个步骤中，各试剂放在冰上融化。对于试剂盒的qPCR MIX(1ml/管)，放在冰上融化后轻微混匀，按需取用，这个我理解了。但是，在加样这个步骤中，各试剂置于冰上，轻微振荡混匀，按要求加入八连排管/PCR板里，加样中涉及到标曲、无模版对照、阴性对照、阳性对照、供试品、供试品加标和qPCR MIX，是否意味着，八连排管/PCR板要预先放在冰上，各个样品也预先放在冰上，整个加样过程必须全程保持在冰上？
2、加样完毕后，如果八连排管/PCR板是放在冰上的，管/板的外壁一定残留有水分，这个需要用到什么来擦拭干净？有资料提到，八连排管/PCR板本身不能用记号笔做标记，外壁也不能频繁触碰，否则会影响读数，那么用来擦拭外壁水分的工具就显得很重要了。

3、各个样品和qPCR MIX都加入到八连排管/PCR板后，上机读数前要确保两种成分，均已得到充分的混匀。八连排管/PCR板要怎么进行振荡？如用到涡旋震荡仪，则要接触管/板的外壁，又会出现上述第2点的担忧。据了解，八连排管/PCR板的专用离心机是有的，而专用震荡仪则没听说过，也可能是我孤陋寡闻。


请老师们不吝赐教，感激不尽

夜光倾透

8连管加入样本DNA后直接离心去除壁挂，通过PCR仪扩增就行了，一般不需要振荡就能正常扩增。 至于你说的放在冰上混匀和加样，目前有低温加样的仪器，可以放8连管和离心管，具体我也没用过，不清楚，可以一起学习下。8连管有不同规格的，我们这边一般用200μL的，用记号笔在管壁上靠上方写上编号，不要写到液位下面就可以了。

jiafei4290

冰上操作理论上能最好的保证酶活性、引物探针的性能。但是这不是绝对的，因为酶里面有保护剂的，短暂的室温放置不会影响酶活性，但是长时间肯定不太好（但是这跟厂家或者酶性能本身也有一定关系）。所以，为了保证万无一失，业内大家都建议置冰上。很多公司有冰盒卖，有可以放0.5/1.5/2.0mL EP管的，也有放8联管或者96孔板的，盒子里面有冷媒可以保证低温，可以避免直接放冰上那种管壁水滴。实际操作中一般就把样品和mix放冰上，室温迅速分装和加样，直接上机跑QPCR了。分装mix的时候，尽量枪头底部靠壁打入，不要有气泡，样品尽量加入底部液体中。如果没有气泡的话，不需要离心&加热时候分子运动自己混匀，但是一般会使用8联管离心机做个short离心把管壁尽可能离下去，同时也是混匀的过程。震荡就不用了，震到管盖了更麻烦！
ABI仪器是顶读信号的，所以尽量不要marker笔标记，会有荧光信号干扰。

hangzhouhdjy

jiafei4290 发表于 2020-10-3 09:55
冰上操作理论上能最好的保证酶活性、引物探针的性能。但是这不是绝对的，因为酶里面有保护剂的，短暂的室温 ...

原来如此，低温是为了保持试剂本身的性能。
您提到的冰盒，这是一个好办法啊，没成想还有这个工具呢。这令我想起了样本消化步骤中的，恒温金属浴/恒温水浴效果对比的事情，与冰盒比较，就是加热和冷藏的区别了。
太感谢了，看来您在这方面了解很多，有机会一定多请教

hangzhouhdjy

夜光倾透 发表于 2020-9-9 16:02
8连管加入样本DNA后直接离心去除壁挂，通过PCR仪扩增就行了，一般不需要振荡就能正常扩增。 至于你说的放在 ...

直接离心就怕混匀不够彻底。
我最初是样本和MIX都加完后，把八连管放在96孔PCR管架上，再置于ELISA试验用的微孔板振荡器来混匀的，最后才是离心并上机检测。
非常感谢您的经验分享

jiafei4290

hangzhouhdjy 发表于 2020-10-13 14:03
原来如此，低温是为了保持试剂本身的性能。
您提到的冰盒，这是一个好办法啊，没成想还有这个工具呢。这 ...

市面上其实很多的。百度下就可以了