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【耀文解读】编码纳米抗体的mRNA联合IgG抗体可预防艰难梭菌感染症状

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药徒
发表于 2023-10-11 10:47:26 | 显示全部楼层 |阅读模式

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[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]注:本文不构成任何投资意见和建议,以官方/公司公告为准;本文仅作医疗健康相关药物介绍,非治疗方案推荐(若涉及),不代表耀海生物立场。任何文章转载需得到授权。
2023年9月5号,塔夫茨大学兽医学院Charles B. Shoemaker 联合mRNA头部企业CureVac在Scietific Reports发表文章:《Co-administration of an effector antibody enhances the half-life and therapeutic potential of RNA-encoded nanobodies》。
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]基于驼类来源的VHH,研究者设计了一种靶向艰难梭菌毒素TcdA和TcdB的多价纳米中和抗体(VNAs, VHH-based neutralizing agents)mRNA序列,向小鼠体内静脉注射编码纳米抗体的VNA-mRNA-LNP,在血清中可检测到足够水平的纳米中和抗体,以保护小鼠免受毒素攻击后的严重疾病进展。
他们还同时构建了一种编码效应抗体的EfAb-mRNA-LNP旨在与纳米中和抗体特异性表位结合,以延长其血清半衰期。共同注射VNA-mRNA-LNP和EfAb-mRNA-LNP或者重组抗体EfAb时,均可增加小鼠和悉生猪仔血清VNA半衰期。在攻毒模型中,VNA血清半衰期的延长与较高浓度的血清VNA及小鼠预防保护效应的增强密切相关。总之,这些研究证实基于mRNA-LNP技术的双组分纳米抗体+效应抗体的治疗潜力一、研究背景1.1 纳米抗体的优劣势常规的IgG抗体是一种大分子免疫球蛋白,分子量为150KDa,由4条肽链组成Y形结构,分别包括2条轻链和2条重链。1989年,科学家在骆驼科动物体内发现一种天然缺失轻链的重链抗体,这种重链抗体的可变区只有15KDa,是常规抗体分子质量的1/10,其蛋白质晶体结构长度为4 nm,直径为2.5 nm,称之为纳米抗体。与常规抗体相比,作为小型、紧密压缩、二硫键稳定的蛋白质,纳米抗体在多种宿主中可以更好地重组表达,并且比 mAb 更能抵抗极端温度或 pH 值。单个或者多聚体的VHH能保留生物学功能,并且,多聚体纳米抗体可显示出更好的亲和力和效力。
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]但VHH有个显著的缺点,那就是缺乏抗体Fc结构域,因此其血清半衰期短,缺乏抗体效应功能,例如,促进病原体调理功能、抗体依赖的细胞毒作用或者补体激活。融合宿主特异性 Fc 区或其他血清丰富的蛋白质(例如白蛋白)可有效改善VHH的血清半衰期,并赋予其额外的生理学功能。然而,这些复杂的重组融合蛋白的表达通常需要更昂贵的真核宿主系统来促进正蛋白质的正确折叠以及糖基化修饰。
1.2 纳米抗体在艰难梭菌感染中的应用
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]艰难梭菌是一种厌氧革兰氏阳性细菌,艰难梭菌在肠道中过度增殖并释放毒素会导致从轻度自愈性腹泻到危机生命的肠膜炎等一系列临床症状。据CDC统计,在2019年,美国约有 20 万感染病例和近 13,000死亡病例。TcdA 和 TcdB是艰难梭菌的两种主要毒力因子。塔夫茨卡明斯兽医学院传染病与全球健康系Charles Shoemaker教授曾经开发了一种异源四聚体纳米抗体(VNA2-Tcd),由两个分别靶向TcdA或者TcdB的双特异性纳米抗体组成,在各种艰难梭菌感染动物模型中均非常有效。
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[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]图1: (A) TcdA 和TcdB 毒素的示意图。(B) 异四聚体VNA2-Tcd 示意图
1.3 mRNA技术或可弥补纳米抗体的缺陷LNP具有天然肝靶向性,静脉注射mRNA-LNP后,宿主肝细胞立即成为蛋白质生产的主要来源。mRNA-LNP技术不仅可应用于疫苗开发,还可应用于基于蛋白质的多种疗法。例如,基因编辑、抗体生产及罕见病治疗等领域。
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]基于mRNA技术编码任意蛋白的特征,研究者设想,利用 mRNA-LNP在体内表达靶向TcdA和TcdB两种抗原的纳米抗体,是否可以作为艰难梭菌感染的候选治疗方案?
二、构建靶向艰难梭菌毒素的纳米抗体mRNA2.1 纳米抗体mRNA的体外表征研究人员根据此前报道过的肉毒梭菌毒素纳米抗体(VNA-BoNTA)的mRNA序列,构建了编码靶向艰难梭菌毒素(TcdA和TcdB)的纳米抗体VNA-mRNA序列,其由两个靶向非重叠毒素表位的VHH、一个信号肽(SP)、两个O-tag标签和一个羧基末端鼠白蛋白结合肽(ABP)组成。此外,他们设计了一种编码TcdA/B异源四聚体纳米抗体的mRNA序列,包括来自TcdA-VNA的两个重链可变区和来自TcdB-VNA的两个重链可变区。将上述构建好的VNA-mRNA转染BHK细胞(仓鼠肾细胞),WB图谱显示mRNA编码的3种类型的艰难梭菌毒素纳米抗体主要表达于细胞上清液中。将细胞上清液进行5倍梯度稀释,利用O-Tag标签特异性的ELISA检测证实其靶标结合的特异性。艰难梭菌毒素触发细胞形态变圆的现象可以用于艰难梭菌感染的诊断和研究。在Vero细胞中检测mRNA编码的艰难梭菌毒素纳米抗体功能,发现VNA-TcdA、VNA-TcdB及VNA-TcdA/B均可防止毒素引发的Vero细胞形态变圆。图2: 纳米中和抗体-mRNA(VNA-mRNA)的体外表征2.2 纳米抗体mRNA的体内表征使用LNP包封mRNA,并注射到小鼠体内,在不同时间点通过O-Tag标签特异性的ELISA定量检测VNA血清滴度。结果显示,VNA-TcdB血清滴度是最高的,所有mRNA-LNP编码的VNA血清滴度均在注射后前两天达到峰值,在第4天发生下降,在第7天仅可略微检测到。
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]单次静脉注射10μg的VNA毒素纳米抗体mRNA-LNP 24小时后,再次注射25ng TcdA或TcdB毒素进行攻毒试验(致死剂量),对细菌毒素引起的毒血症相关症状进行评估。注射VNA-TcdA、VNA-TcdB或者VNA-TcdA/B的小鼠出现轻度或中度临床症状,通常在2天内消退。所有注射VNA-BoNTA(肉毒梭菌毒素纳米抗体)的小鼠在受到任何一种毒素攻击时都出现了严重的毒血症症状。这些数据证实mRNA-LNP 编码的纳米抗体在体内发挥出应有的抗毒素功能。
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[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)] 图3: 纳米中和抗体-mRNA(VNA-mRNA)的体内表征
三、构建靶向亲和标签的效应抗体mRNA
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]纳米抗体VNA在小鼠中的血清半衰期仅为1-2小时,添加ABP(白蛋白结合肽), 可将血清半衰期延长至约一天。为了进一步改善纳米抗体血清半衰期并增加Fc效应功能,研究人员构建了高亲和力大鼠抗O-Tag标签的mAb作为效应抗体(EfAb),其能与VNA纳米抗体上的O-Tag标签表位特异性结合。研究人员将此抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)嵌入到人IgG1框架中。为了优化蛋白质表达,在本项研究中,研究者最终选择编码重链(HC)和轻链(LC)的mRNA比例为1.2:1。
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]根据过往研究结果,研究者将EfAb-mRNA-LNP在小鼠体内的注射剂量设定为2.5μg~40μg,而将重组抗体EfAb的注射剂量设定为10μg~250μg。在小鼠模型中,当EfAb-mRNA-LNP注射剂量增加4倍时,EfAb表达水平增加4倍以上,也就是说EfAb-mRNA-LNP注射剂量与其表达出来的EfAb呈现一条超线性曲线。相反,重组抗体EfAb的注射剂剂量与其对应的血清水平呈现密切的线性关系。在注射VNA-mRNA-LNPs24小时后,研究者观察到类似的超线性血清VNA剂量曲线。有趣的是,在非人灵长类动物中没有观察到静脉注射后的这种超线性剂量反应。
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]基于上述研究结果,研究人员预估10 μg EfAb-mRNA-LNP或100 μg重组抗体EfAb与2.5μg VNA-mRNA-LNP共同给药后,血清EfAb水平足以结合血清VNA上存在的所有O-Tag标签。
四、效应抗体联合给药的测定4.1 效应抗体联合给药,延长纳米抗体半衰期将2.5μg的VNA-TcdB-mRNA-LNPs与100μg鼠源重组抗体EfAb或10μg 人源EfAb-mRNA-LNP共同注射到小鼠体内。在没有注射鼠源重组抗体EfAb的情况下,VNA-TcdB的血清滴度在7天后会下降到其初始峰值水平的约1%;相反,与鼠源重组抗体EfAb共同给药的情况下,VNA-TcdB血清滴度注射第7天时仍然保持在峰值水平的50%左右。
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图4: 联合注射效应抗体可以延长VNA的血清滴度当共同注射人源化EfAb-mRNA-LNP和VNA-TcdB-mRNA-LNPs时,只有一部分小鼠表现出与使用鼠源重组蛋白EfAb观察到的类似的血清半衰期延长现象。研究者证实这种血清半衰期延长异质性的现象是由于抗药物抗体(anti-drug-antibody,ADA)触发的,也就是说如果不让机体对VNA和EfAb进行脱敏,那么针对VNA和EfAb的ADA反应可以在一些小鼠给药后约一周迅速激活,严重降低这些药物的血清半衰期。4.2 效应抗体联合给药,增强纳米抗体预防小鼠中毒效果
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]研究人员发现,在攻毒试验后(毒素剂量为初始攻毒试验的2倍),仅仅注射VNA-TcdA或VNA-TcdB mRNA-LNP要比共同注射EfAb-mRNA-LNP的小鼠表现出更加严重的中毒迹象。尽管接受EfAb共同注射的小鼠症状相对较轻,在毒素攻击后没有发生死亡,而所有缺乏EfAb的小鼠在TcdA攻击下发生死亡(5/5)。在TcdB攻击下,所有缺乏EfAb的小鼠出现了更严重的临床症状,并且,两只老鼠出现死亡(2/5)。研究人员在5只临床症状非常严重的小鼠血清中检测不到VNA或EfAb水平,这说明ADA效应会导致纳米抗体的抵御毒素的保护效应受到严重降低。综上所述,在不触发ADA效应的情况下,EfAb共表达显著增强纳米抗体预防小鼠发生严重中毒的治疗窗口时间。
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[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]图5: 效应抗体联合给药可增强纳米抗体mRNA的保护效力
4.3 效应抗体联合给药,增强仔猪模型中纳米抗体血清滴度和半衰期为了在更适合人类肠道疾病研究的大型动物模型中确认EfAb对VNA-TcdB的血清滴度和半衰期的影响,研究人员在悉生仔猪模型中检测纳米抗体药代动力学特征(PK)。在仔猪模型中,VNA-mRNA编码的纳米抗体上的鼠ABP组分不会结合猪白蛋白。因此,在没有EfAb存在的情况下,VNA-mRNA编码的纳米抗体在血清中的滴度具备其天然药代动力学特征。将VNA-TcdB-mRNA-LNP和EfAb-mRNA-LNP共注射到仔猪体内,在注射后第一天,VNA-TcdB血清滴度到达到峰值,并在第5天扔保持在峰值水平。在注射5天后,VNA-TcdB和EfAb血清滴度开始稳步下降,这两组蛋白的血清半衰期均为一周。当在猪仔体内只注射VNA-TcdB-mRNA-LNP时,即便注射剂量是共注射时的5倍之高,VNA-TcdB血清滴度峰值仍然要比与EfAb共注射时低。而且,随着时间的增加,VNA-TcdB血清滴度快速下降。此外,用对照组mRNA-LNP代替EfAb-mRNA-LNP共同给药会导致VNA-TcdB血清滴度峰值水平降低十倍。
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]总之,共注射EfAb可显著提升仔猪模型中VNA-TcdB的血清丰度和半衰期。
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[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]图6: 共注射EfAb可显著提升仔猪模型中VNA-TcdB的血清丰度和半衰期
五、小结这项研究的最大创新之处在于,研究者利用mRNA-LNP技术,成功地在体内表达了异源多聚体的纳米抗体。并且,通过共注射编码效应抗体的mRNA(这些效应抗体可以通过亲和标签与靶向毒素的纳米抗体结合),实现了血清中靶向毒素的纳米抗体的丰度和半衰期的显著提高,从而增强了纳米抗体预防小鼠发生严重中毒症状的效力。此外,还需要特别注意ADA效应,以防止对纳米抗体和效应抗体的血清滴度产生严重影响。对于效应抗体而言,可能只需使用经过修饰的IgG来降低免疫原性,这种修饰已经被广泛用于减少IgG治疗剂对人类和兽医动物的免疫原性。总之,这项研究对于探索基于mRNA技术的纳米抗体应用、以及如何改善纳米抗体的血清半衰期,具有非常重要的借鉴意义。基于在mRNA制备方面的开创技术和丰富经验,耀海生物可为全球客户提供mRNA一站式制备服务,涵盖mRNA小样制备、工艺开发、分析方法开发、LNP制剂开发、GMP生产。耀海生物还可提供各种预制型mRNA产品,编码蛋白涵盖报告基因、靶点蛋白、基因编辑蛋白和抗原蛋白,包括eGFP、mCHERRY、luciferase、IL-2、Cas9、OVA、新冠S蛋白等,以满足不同的实验或项目需求。详情可咨询菌菌:13380332910(微信同号)。
参考文献
[1] Thran M, Pönisch M, Danz H, Horscroft N, Ichtchenko K, Tzipori S, Shoemaker CB. Co-administration of an effector antibody enhances the half-life and therapeutic potential of RNA-encoded nanobodies. Sci Rep. 2023 Sep 5;13(1):14632. doi: 10.1038/s41598-023-41092-7.[2] Schmidt DJ, Beamer G, Tremblay JM, Steele JA, Kim HB, Wang Y, Debatis M, Sun X, Kashentseva EA, Dmitriev IP, Curiel DT, Shoemaker CB, Tzipori S. A Tetraspecific VHH-Based Neutralizing Antibody Modifies Disease Outcome in Three Animal Models of Clostridium difficile Infection. Clin Vaccine Immunol. 2016 Sep 6;23(9):774-84. doi: 10.1128/CVI.00730-15.
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)][3] Thran M, Mukherjee J, Pönisch M, Fiedler K, Thess A, Mui BL, Hope MJ, Tam YK, Horscroft N, Heidenreich R, Fotin-Mleczek M, Shoemaker CB, Schlake T. mRNA mediates passive vaccination against infectious agents, toxins, and tumors. EMBO Mol Med. 2017 Oct;9(10):1434-1447. doi: 10.15252/emmm.201707678.
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药徒
 楼主| 发表于 2023-10-11 11:02:15 | 显示全部楼层

【耀文解读】mRNA产品相关杂质dsRNA检测:ELISA试剂盒

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]注:本文不构成任何投资意见和建议,以官方/公司公告为准;本文仅作医疗健康相关药物介绍,非治疗方案推荐(若涉及),不代表耀海生物立场。任何文章转载需得到授权。
导读:dsRNA是IVT mRNA产品相关杂质(Product-related impurities),其残留量是mRNA药物的关键质量属性。利用T7 RNA聚合酶体外转录(IVT, In Vitro Transcription)制备mRNA的过程,同时会产生短链RNA、双链RNA(dsRNA, double-stranded RNA)等副产物,其中dsRNA可被RIG-I样受体(RIG-I like receptors,RLRs)识别,继而触发机体的天然免疫反应;另外,dsRNA可激活寡聚腺苷酸合成酶(OSA, oligoadenylates synthesis),从而结合并激活RNase L,导致mRNA发生降解。本期文章菌菌将分享mRNA产品相关杂质dsRNA检测方法,涵盖dsRNA的产生机制与检测方法。
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]一、mRNA质量分析相关法规
目前mRNA技术的应用仍处于科学前沿,在开发和生产过程中mRNA质量相关的监管法规和行业标准处于快速发展阶段。NMPA、WHO和USP均发布了关于mRNA检测项和分析方法开发的规范,建议对DNA原材料、mRNA原液和LNP制剂进行全面的检测放行,从而保证工艺的稳定性和终产品质量的均一性。其中质粒模板的分析方法开发和检测技术已经趋于成熟,菌菌在此不过多阐述。mRNA原液的质量检测项包括:mRNA含量和鉴别、完整性、加帽率、poly A尾分布,以及模板DNA、双链RNA(dsRNA)、T7 RNA聚合酶、加帽酶、2-O-甲基转移酶、DNAase I、内毒素、抗生素等工艺或产品相关残留。mRNA-LNP制剂的质量检测项包括:mRNA鉴别和完整性、LNP-mRNA包封率、纳米颗粒粒径、LNP各组分鉴别及含量等。2022年美国药典(USP)制定的《mRNA疫苗质量分析方法》草案中,建议免疫印迹法(Immunoblot)用于dsRNA的检测。而在2023年,USP对草案内容进行了更新,新增了ELISA方法用于检测dsRNA残留。二、dsRNA检测方法
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]基于IVT的mRNA生产工艺会形成副产物dsRNA,主要基于两种机制:①基于RNA依赖性RNA聚合酶,产生的dsRNA为分子内双链,长度短于runoff转录本;②基于DNA依赖性且独立于启动子的RNA聚合酶,转录生成反义链RNA,与runoff转录本反向互补形成dsRNA,该机制下形成的dsRNA长度与runoff转录本一致。
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]菌菌在前期文章中对dsRNA形成机制做了详细解读,点击链接即可查看:【耀文解读】mRNA质量分析系列Part 3:dsRNA检测方法
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]图1: IVT过程中dsRNA的可能形成机制
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]当前,针对mRNA产品相关杂质dsRNA的检测方法包括免疫印迹和ELISA,基本原理为使用dsRNA特异性抗体J2检测dsRNA。分析方法简述如下:
2.1 免疫印迹法
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]免疫印迹法(Immunoblot)利用dsRNA特异性抗体来检测IVT反应中dsRNA含量。J2抗体是一种抗dsRNA抗体,可特异性识别并结合dsRNA,根据特定信号鉴别样品中是否存在dsRNA(定性检测)。定量分析待测样品的dsRNA残留时,需要制备合适的标准对照品。该方法依赖于抗体对dsRNA的特异性识别作用,而mRNA二级结构或修饰核苷酸可能改变抗体对dsRNA结构的识别,需进行专门的研究。注意:抗体检测的灵敏度与dsRNA区域的长度有关,需调整检测的灵敏度以确保dsRNA可被检测。
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]图2: 免疫印迹法检测dsRNA
2.2 ELISA酶法免疫印迹法ELISA是当前dsRNA检测的常用方法,可采用尼龙膜或商业化酶联免疫法(ELISA)试剂盒。使用尼龙膜上样需优化上样体积,以使各样品扩散程度一致,减少对结果精确度的影响。商业化试剂盒检测过程相对简单。以某ELISA试剂盒为例,基于双抗体夹心酶联免疫法,使用捕获抗体包被微孔板,形成固相抗体,向固相抗体微孔板中加入dsRNA校准品和待测样品,然后加入检测抗体,最后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的酶标二抗,形成“包被抗体-dsRNA-酶标检测抗体”复合物,经过洗涤后加入显色液显色,终止反应后使用酶标仪检测吸光值,吸光值与样品中dsRNA的量呈相关性。针对商业化ELISA试剂盒,耀海团队进行了dsRNA 残留检测适用性测试。我们按照ELISA试剂盒说明书,配制了标曲并设置QC质控点。结果显示,拟合标曲R2= 0.999,QC回收率=105.5%。提示该方法dsRNA适用性检测结果良好。
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]图3: dsRNA 残留检测适用性测试(耀海平台)
三、结论mRNA技术应用场景广阔,预防性疫苗管线覆盖流感、RSV、CMV、HIV,治疗性疫苗/药物靶点包括肿瘤抗原、抗体、细胞因子、造血因子、干扰素、白介素、酶等。为推动mRNA药物的产业化及临床应用,其质量研究方法是需要攻克的一大难关。在生产工艺开发及GMP生产的同时,需要有完整、灵敏、重复性好的分析方法做支持。耀海生物质量研究服务平台,目前已具备针对30多种mRNA原液或LNP制剂成品质量属性的方法开发和检测能力。检测项目覆盖质粒纯度、超螺旋比例、浓度、杂质;mRNA原液完整性、加帽率、poly A尾分布、以及模板DNA、双链RNA(dsRNA)、T7 RNA聚合酶、加帽酶、2-O-甲基转移酶、DNAase I、内毒素、抗生素等工艺或产品相关杂质;LNP-mRNA成品包封率、粒径、Zeta电位、LNP组分与含量,可为 mRNA 疫苗与药物研发提供更准确、更快速、更灵敏的分析检测,全面满足客户项目研发需求。详情可咨询菌菌:13380332910(微信同号)
参考文献
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)][1] Bijoyita Roy, Monica Z. Wu. Understanding and Overcoming the Immune Response from Synthetic mRNAs. Genetic Engineering & Biotechnology News. 2019 Dec 19; 39(12):56-58.
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)][2] Schönborn J, Oberstrass J, Breyel E, Tittgen J, Schumacher J, Lukacs N. Monoclonal antibodies to double-stranded RNA as probes of RNA structure in crude nucleic acid extracts. Nucleic Acids Res. 1991 Jun 11;19(11):2993-3000. doi: 10.1093/nar/19.11.2993.
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)][3] 药品审评中心. 新型冠状病毒预防用mRNA疫苗药学研究技术指导原则(试行). 2020.
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)][4] USP. Analytical Procedures for mRNA Vaccines–Draft. 2022.
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)][5] WHO. Evaluation of the quality, safety and efficacy of messenger RNA vaccines for the prevention of infectious diseases: regulatory considerations. 2021.


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药徒
 楼主| 发表于 2023-10-11 11:05:12 | 显示全部楼层

【耀文解读】mRNA polyA尾分布检测:酶切处理与LC-MS分析

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]注:本文不构成任何投资意见和建议,以官方/公司公告为准;本文仅作医疗健康相关药物介绍,非治疗方案推荐(若涉及),不代表耀海生物立场。任何文章转载需得到授权。
导读:足够长度的poly A尾是维持mRNA稳定性和翻译效率必需条件之一。在质粒扩增过程或mRNA合成工艺中,poly A尾巴可能会发生缩短。因此, poly A尾分布是mRNA原液的关键质量指标之一
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]本期文章菌菌将分享mRNA polyA尾分布检测方法,涵盖酶切处理(前处理)、基于LC-MS的多聚腺苷酸分析。菌菌主要参考了CDE、WHO指导原则,以及美国药典USP推荐的质量检测项和分析方法。
一、mRNA质量分析相关法规目前mRNA技术的应用仍处于科学前沿,在开发和生产过程中mRNA质量相关的监管法规和行业标准处于快速发展阶段。NMPA、WHO和USP均发布了关于mRNA检测项和分析方法开发的规范,建议对DNA原材料mRNA原液LNP制剂进行全面的检测放行,从而保证工艺的稳定性和终产品质量的均一性。其中质粒模板的分析方法开发和检测技术已经趋于成熟,菌菌在此不过多阐述。mRNA原液的质量检测项包括:mRNA含量和鉴别、完整性、加帽率、poly A尾分布,以及模板DNA、双链RNA(dsRNA)、T7 RNA聚合酶、加帽酶、2-O-甲基转移酶、DNAase I、内毒素、抗生素等工艺或产品相关残留。mRNA-LNP制剂的质量检测项包括:mRNA鉴别和完整性、LNP-mRNA包封率、纳米颗粒粒径、LNP各组分鉴别及含量等。二、mRNA polyA尾分布检测据文献报道,polyA尾分布有两类策略:①与加帽率的分析策略类似,核酸酶酶切后纯化回收3’端polyA尾,随后通过毛细管电泳(CE)、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、高效液相色谱(HPLC)或液相色谱质谱联用(LC-MS),对polyA尾进行定性和定量分析。②基于二代或三代测序技术表征polyA,已报道的测序方法包括TAIL-seq、PAL-seq、FLAM-Seq和PAIso-Seq等。基于核酸酶切割的poly A尾长度分析策略使用较为广泛,使用RNase T1将mRNA 3’端polyA切割纯化,然后通过高分辨LC-MS分离鉴别不同长度的polyA序列。2.1 酶切处理据2018年诺华公司Beverly M等发表的文章:《Poly A tail length analysis of in vitro transcribed mRNA by LC-MS》,研究人员基于RNAse T1酶切与oligo dT磁珠纯化得到3’端polyA尾,使用液相色谱质谱联用(LC-MS)检测polyA尾长度的分布。具体步骤包括:RNase T1酶切、mRNA 3’端polyA磁珠纯化(oligo dT)。RNase T1酶切:内切酶RNase T1可特异性地在单链RNA的鸟嘌呤核糖核苷酸(G)后进行切割,可用于切割mRNA 3’端聚腺苷(polyA)片段。100 pmol mRNA加热至95℃后迅速降至25℃,随后加入10×RNase H缓冲液、2 μl RNase T1酶(100 μl体系),37℃孵育3小时。磁珠纯化:通过polyA尾与oligo dT磁珠特异性结合进行纯化,使用0.1 M醋酸铵溶液清洗磁珠,随后加入75%甲醇,80℃孵育1 min,洗脱polyA片段。③换液:通过旋转蒸发去除甲醇,重悬于含1%甲醇的0.1 mM EDTA溶液,用于LC-MS分析。2.2 LC-MS分析polyA片段LC-MS分析:使用高分辨液相质谱联用仪,固定相为ACQUITY C18色谱柱,流动相A为200 mM六氟异丙醇+8.15 mM三乙胺(pH 7.9),流动相B为100%MeOH。洗脱条件为:5%B洗脱1min,1-12 min内B浓度由5%线性增加到25%,然后90%B冲洗1min后恢复5%B。紫外波长设置为260 nm。HPLC与MS的分辨率:当polyA长度为27 nt时,高效液相色谱(HPLC)可有效分离相差一个腺苷的polyA,但当碱基个数增加至64或100,HPLC未能有效分离相差一个腺苷的polyA(图1a)。而质谱(MS)可弥补这一缺陷,当polyA长度为100 nt,电喷雾质谱图可精确检测任一不同分子量的polyA(即不同长度的polyA),通过峰强度对polyA长度分布进行相对定量(图1b)。
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]图1: mRNA样品的polyA尾分析(上图为离子色谱图,下图为电喷雾质谱图)
结合mRNA分析方法学相关法规和文献,我们分享了一种分析mRNA polyA尾分布的方法。该方法基于RNase T1将polyA从mRNA序列上切割下来,通过dT磁珠特异性捕获polyA,然后借助高分辨LC-MS,定量分析mRNA的polyA尾长度分布。基于该策略的可替代方法包括:根据核苷酸序列特性,使用其他RNA酶(如RNase A或RNase H)代替RNase T1,以获得polyA片段,随后通过毛细管电泳、HPLC对短核苷酸进行分离与定量分析。基于上述方法,菌菌团队建立了mRNA polyA尾分布检测平台。基于我们摸索的酶切处理和LC分离条件,质谱图可精确分离核苷酸长度相差为1的polyA片段。该方法可满足酶切处理及LC-MS分析的全流程mRNA polyA尾分析需求。
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]图2: LC-MS分析mRNA polyA的一级质谱图
三、结论mRNA技术应用场景广阔,预防性疫苗管线覆盖流感、RSV、CMV、HIV,治疗性疫苗/药物靶点包括肿瘤抗原、抗体、细胞因子、造血因子、干扰素、白介素、酶等。为推动mRNA药物的产业化及临床应用,其质量研究方法是需要攻克的一大难关。在生产工艺开发及GMP生产的同时,需要有完整、灵敏、重复性好的分析方法做支持。耀海生物质量研究服务平台,目前已具备针对30多种mRNA原液或LNP制剂成品质量属性的方法开发和检测能力。检测项目覆盖质粒纯度、超螺旋比例、浓度、杂质;mRNA原液完整性、加帽率、poly A尾分布、以及模板DNA、双链RNA(dsRNA)、T7 RNA聚合酶、加帽酶、2-O-甲基转移酶、DNAase I、内毒素、抗生素等工艺或产品相关残留;LNP-mRNA成品包封率、粒径、Zeta电位、LNP组分与含量,可为 mRNA 疫苗与药物研发提供更准确、更快速、更灵敏的分析检测,全面满足客户项目研发需求。详情可咨询菌菌:13380332910(微信同号)
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)][1] Beverly M, Hagen C, Slack O. Poly A tail length analysis of in vitro transcribed mRNA by LC-MS. Anal Bioanal Chem. 2018 Feb;410(6):1667-1677. doi: 10.1007/s00216-017-0840-6.
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)][2] 药品审评中心. 新型冠状病毒预防用mRNA疫苗药学研究技术指导原则(试行). 2020.
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)][3] USP. Analytical Procedures for mRNA Vaccines–Draft. 2022.
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)][4] WHO. Evaluation of the quality, safety and efficacy of messenger RNA vaccines for the prevention of infectious diseases: regulatory considerations. 2021.

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药徒
 楼主| 发表于 2023-10-11 11:07:51 | 显示全部楼层

【耀文解读】mRNA加帽率检测:探针设计、酶切处理与LC-MS分析导读

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]注:本文不构成任何投资意见和建议,以官方/公司公告为准;本文仅作医疗健康相关药物介绍,非治疗方案推荐(若涉及),不代表耀海生物立场。任何文章转载需得到授权。
mRNA的帽结构可维持体内稳定性,促进蛋白的翻译。加帽率是mRNA疫苗或药物的关键质量指标,带帽结构的mRNA占比可影响mRNA的免疫原性和翻译效率。
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]本期文章菌菌将分享基于RNase H的mRNA加帽率检测方法,涵盖探针设计、酶切处理(前处理)、基于LC-MS的寡核苷酸分析。菌菌主要参考了CDE、WHO指导原则,以及美国药典USP推荐的质量检测项和分析方法。
一、mRNA质量分析相关法规目前mRNA技术的应用仍处于科学前沿,在开发和生产过程中mRNA质量相关的监管法规和行业标准处于快速发展阶段。NMPA、WHO和USP均发布了关于mRNA检测项和分析方法开发的规范,建议对DNA原材料mRNA原液LNP制剂进行全面的检测放行,从而保证工艺的稳定性和终产品质量的均一性。其中质粒模板的分析方法开发和检测技术已经趋于成熟,菌菌在此不过多阐述。mRNA原液的质量检测项包括:mRNA含量和鉴别、完整性、加帽率、poly A尾分布,以及模板DNA、双链RNA(dsRNA)、T7 RNA聚合酶、加帽酶、2-O-甲基转移酶、DNAase I、内毒素、抗生素等工艺或产品相关残留。
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]mRNA-LNP制剂的质量检测项包括:mRNA鉴别和完整性、LNP-mRNA包封率、纳米颗粒粒径及多分散系数(PDI)、LNP各组分鉴别及含量等。
二、mRNA加帽率检测加帽率是mRNA疫苗或药物的关键质量指标。加帽与未加帽的mRNA仅相差一个核苷酸(m7G),相对于一千至几千碱基的完整mRNA序列来说占比过小,难以区分。当前已建立的加帽率检测思路为:采用酶切方式(RNase H或核酶)获得5’端加帽或不加帽的寡核苷酸序列,随后对不同大小的寡核苷酸片段进行分离与相对定量分析,方法包括尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(尿素变性PAGE)、高效液相色谱(HPLC)、液相质谱联用(LC-MS)或毛细管电泳(CE)等,从而定量分析mRNA的加帽率。
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]其中较为成熟的一种加帽率分析方法为:设计特异性探针并使用RNase H进行酶切处理,然后通过高分辨LC-MS鉴别不同长度的寡核苷酸。
2.1 探针设计mRNA探针的设计主要参考H Inoue等发表的文献《Sequence-specific cleavage of RNA using chimeric DNA splints and RNase H》。菌菌前期对这篇文章进行了详细解读,点击连接即可查看:mRNA加帽率检测中RNase H切割探针的设计研究人员以9个核糖核苷酸组成的RNA链[5’-32P]pACUUACCUG作为目标序列,设计与其互补配对的寡核苷酸杂交链,当寡核苷酸杂交链包含互补的脱氧核糖核苷酸(短DNA序列)和2’-O-甲基修饰的核糖核苷酸(短RNA序列)时,[5’-32P]pACUUACCUG中可被RNase H特异性识别并切割,识别位点在短DNA序列对应的互补序列中。3’-m(UG)-d(AATG)-m(GAC)-5’作为杂交链时,*pACUUACCUG在C6和C7之间被切割,生成*pACUUAC。3’-m(UGAA)-d(TGGA)-m(C)-5’作为杂交链时,RNase H对*pACUUACCUG的切割位点主要在U8和C9之间,生成*pACUUACCU。
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]探针由2’-O-甲基修饰的短RNA序列和4-6个短DNA序列组成,RNase H无法识别2’-O-甲基修饰的RNA序列,但探针5’端的短DNA序列会引导RNase H在与其互补配对的RNA序列的特定位置进行切割。根据该文章对RNase H切割探针的设计思路, mRNA加帽率检测中RNase H切割探针的设计原则如下:
a)探针序列由短RNA序列和短DNA序列嵌合而成,与目标RNA链互补配对;b)切割位点由4-6个脱氧核糖核苷酸组成(短DNA序列);c)其余核苷酸均由2’-O-甲基化的核糖核苷酸组成(甲基化的短RNA序列);d)出于产物纯化的考量,3’端标记生物素。
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]图1: 嵌合双链的设计与RNase H切割位点
2.2 酶切处理据2016年诺华公司Beverly M等在发表的一篇文章《Label-free analysis of mRNA capping efficiency using RNase H probes and LC-MS》描述,设计并合成探针后,需要进行酶切处理,以获得LC-MS检测样品。具体步骤包括:退火、磁珠结合、RNase H酶切、以及mRNA 5’端寡核苷酸的磁珠纯化。退火反应。反应体系包括500 pmol RNase H探针(生物素标记)、10×RNase H缓冲液和100 pmol mRNA,使用5倍量的探针以保证全部mRNA与探针结合,500 pmol是与磁珠结合的的探针最大量。反应条件为:将探针与mRNA混合,在95℃退火5 min,随后以2 min的间隔降至65℃、55℃、40℃,最后降至22℃。
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]磁珠结合、酶切与纯化。①结合:将退火的mRNA和探针加入预处理过的链霉亲和素磁珠中,室温孵育30 min。加入50 U RNase H,吹打混匀后在37℃下孵育3小时,然后置于磁力架,弃上清。②清洗:用含1M NaCl的清洗缓冲液(5mM Tris-HCl, 0.5mM EDTA, pH7.5)洗涤3次以去除酶、mRNA和反应缓冲液;然后用蒸馏水洗涤3次以除去过量的盐。③洗脱:加入75%甲醇(80℃预热),于80℃孵育1 min洗脱mRNA酶切片段。④换液:通过旋转蒸发干燥洗脱产物,重悬于含1%甲醇的0.1 mM EDTA溶液,用于LC-MS分析。
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]图2: 基于RNase H与磁珠,mRNA 5’端寡核苷酸的捕获
2.3 LC-MS分析寡核苷酸药物极性较大,在常规的反相色谱条件下保留较弱,需要在流动相中添加离子对试剂。目前较常用的混合离子对试剂主要包括三乙基乙酸铵(TEAA)、三乙胺-六氟异丙醇(TEA-HFIP)、三乙胺/丙胺-乙酸盐(TEA/PA-AA)以及N-乙基二异丙胺-六氟异丙醇(DIPEA-HFIP)等。详情可查看:高分辨质谱在寡聚核苷酸药物质量研究方面的应用之离子对试剂的选择LC-MS分析。Beverly M等使用液相高分辨质谱联用仪,固定相为ACQUITY UPLC C18色谱柱,流动相A为200 mM六氟异丙醇+8.15 mM三乙胺(pH 7.9),流动相B为100%MeOH。洗脱条件为:5%B洗脱1min,1-12 min内B浓度由5%线性增加到25%,然后90%B冲洗1min后恢复5%B。紫外波长设置为260 nm。
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]LC-MS分离效果。与含有二磷酸、三磷酸或未甲基化G cap(GpppG)相比,含有甲基化M7GpppG帽结构的切割片段,其质量差异有助于加帽率的鉴定。如图所示,借助反相色谱柱进行液相-质谱分析,可有效分离Cap 1与未加帽的三磷酸mRNA切割片段。除预期的寡核苷酸片段外,还存在RNase H第二个识别位点及生物素探针,生物素探针的出现可能是由于洗脱条件苛刻。
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]图3: 基于RNase H的加帽率分析. 上图为总离子色谱图; 下图为电喷雾质谱.
结合mRNA分析方法学相关法规和文献,我们分享了一种定量分析mRNA加帽率的方法。该分析方法基于链霉亲和素磁珠特异性捕获生物素标记的探针,mRNA 5’端序列与探针结合,从而被RNase H识别并切割,经过清洗、洗脱得到mRNA 5’端单链寡核苷酸序列。然后通过LC-MS、离子对试剂分离带或不带帽结构的寡核苷酸,从而得出mRNA的加帽率。
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]基于上述方法,菌菌团队建立了mRNA加帽率检测平台,可满足探针设计、酶切处理及LC-MS分析的全流程mRNA加帽率分析。
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]
三、结论mRNA技术应用场景广阔,预防性疫苗管线覆盖流感、RSV、CMV、HIV,治疗性疫苗/药物靶点包括肿瘤抗原、抗体、细胞因子、造血因子、干扰素、白介素、酶等。为推动mRNA药物的产业化及临床应用,其质量研究方法是需要攻克的一大难关。在生产工艺开发及GMP生产的同时,需要有完整、灵敏、重复性好的分析方法做支持。耀海生物质量研究服务平台,目前已具备针对30多种mRNA原液或LNP制剂成品质量属性的方法开发和检测能力。检测项目覆盖质粒纯度、超螺旋比例、浓度、杂质;mRNA原液完整性、加帽率、poly A尾分布、以及模板DNA、双链RNA(dsRNA)、T7 RNA聚合酶、加帽酶、2-O-甲基转移酶、DNAase I、内毒素、抗生素等工艺或产品相关残留;LNP-mRNA成品包封率、粒径、Zeta电位、LNP组分与含量,可为 mRNA 疫苗与药物研发提供更准确、更快速、更灵敏的分析检测,全面满足客户项目研发需求。详情可咨询菌菌:13380332910(微信同号)
参考文献
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)][1] Inoue H, Hayase Y, Iwai S, Ohtsuka E. Sequence-dependent hydrolysis of RNA using modified oligonucleotide splints and RNase H.FEBS Lett. 1987;215(2):327–30.
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)][2] Beverly M, Dell A, Parmar P, et al. Label-free analysis of mRNA capping efficiency using RNase H probes and LC-MS. Anal Bioanal Chem. 2016 Jul;408(18):5021-30. doi: 10.1007/s00216-016-9605-x.
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)][3] 药品审评中心. 新型冠状病毒预防用mRNA疫苗药学研究技术指导原则(试行). 2020.
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)][4] USP. Analytical Procedures for mRNA Vaccines–Draft. 2022.
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)][5] WHO. Evaluation of the quality, safety and efficacy of messenger RNA vaccines for the prevention of infectious diseases: regulatory considerations. 2021

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 楼主| 发表于 2023-10-11 11:15:51 | 显示全部楼层

【耀文解读】mRNA-LNP粒径检测:动态光散射(DLS)法

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]注:本文不构成任何投资意见和建议,以官方/公司公告为准;本文仅作医疗健康相关药物介绍,非治疗方案推荐(若涉及),不代表耀海生物立场。任何文章转载需得到授权。
导读:新冠疫情的爆发加速了mRNA疫苗技术的产业化,mRNA技术是生物制品的一大突破。作为一种应用于临床的创新型技术,mRNA工艺路线的开发和放大必须借助于成熟的质量分析方法,以确定mRNA的纯度、完整性、粒径、分散系数、高级结构以及其他关键质量参数,才能确保mRNA疫苗或药物的批稳定性,确保其安全性和疗效2023 年 2 月 14 日,伦敦帝国学院的Robin J. Shattock教授作为通讯作者在Biology Methods & Protocls发表文章:《Biophysical characterization of the structure of a SARS-CoV-2 self-amplifying RNA (saRNA) vaccine》。研究者采用紫外(UV)光谱、毛细管电泳(CE)、生物小角X射线散射(BioSAXS)、动态光散射(DLS)和圆二色谱(CD)来表征新冠自复制mRNA疫苗的纯度、完整性粒径散系数高级结构等关键质量属性。
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]今天的文章,菌菌将分享mRNA-LNP粒径检测的方法——动态光散射(DLS)
一、动态光散射(DLS)工作原理
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]动态光散射(DLS, dynamic light scattering),也成为光子相关光谱学(PCS),是一种成熟的非侵入技术。DLS能够检测小于1 nm粒度的颗粒,可用于测量亚微米范围内的分子与颗粒的粒度及粒度分布。DLS的检测原理为,悬浮的微粒与液体分子间因相互撞击作用而存在布朗运动,造成散射光光强的波动。DLS即根据光的散射原理进行颗粒平均粒度大小的检测。对这些颗粒波动的分析可得出平移扩散系数(D),它是样品中颗粒布朗运动速度的度量,使用斯托克斯-爱因斯坦(Stokes-Einstein)方程,将平移扩散系数(D)可以转换为颗粒尺寸。样品颗粒尺寸通常以 Z 平均直径(Z-Average)的形式展示,定义为强度加权平均流体动力学直径。流体动力学直径(DH)定义为以与被测颗粒或分子有相同扩散速度的球体直径。除Z-Average外,DLS分析还能获得样品的多分散系数(PDI, Polydispersity index)。PDI 是对数据累积分析得出的颗粒尺寸分布宽度的无量纲数值。PDI 值范围为 0 到 1,值越高表示多分散性越强,数值越小表示粒度越均匀。
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]动态光散射(DLS)最初被美国药典USP<729>收录为脂肪乳剂平均粒径检测的方法。鉴于DLS的高准确性和高精密度,目前其应用领域已拓展至医药化工领域。mRNA-LNP的关键质量指标是颗粒大小,其会影响mRNA-LNP的生物分布和细胞摄取。2020年CDE发布的《新型冠状病毒预防用mRNA疫苗药学研究技术指导原则(试行)》、2021年WHO发布的《传染病预防性mRNA疫苗质量、安全性及有效性评估》、以及2023年美国药典更新的《USP-mRNA疫苗质量分析方法草案》中,DLS被建议用于mRNA-LNP样品的平均粒径和多分散性系数(PDI)检测。
二、动态光散射(DLS)法检测LNP粒径
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]据文献报道,伦敦帝国理工学院Robin J. Shattock团队开发了一款新冠候选疫苗:自复制mRNA疫苗IMP-1,由委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)复制酶和新冠病毒融合前构象的Spike蛋白组成。Robin J. Shattock教授发文展示了基于DLS检测mRNA-LNP粒径的质量分析方法,分析方法如下:
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]首先,研究人员通过体外转录(IVT)、纯化制备得到长度大于10 kb的新冠自复制mRNA,随后将其包封在LNP中,作为DLS检测样品。将mRNA-LNP稀释至一定浓度(0.245 mg/ml),置于石英毛细管。上步操作使用了3种缓冲液:5mM 柠檬酸钠, pH 6.8(BioSAXS运行缓冲液)、10 mM磷酸钠, pH 7(CD分析缓冲液)和ddH2O。使用DLS设备和软件系统检测LNP颗粒粒度和多分散系数,并完成数据处理。
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]DLS分析结果显示,在SAXS 运行缓冲液和 CD 分析缓冲液下数据均出现单峰。对于 SAXS 运行缓冲液中的 mRNA疫苗样品,平均流体动力学直径为 857.6 ± 19.2 &#197;,对应的纳米级为85.76 nm,相应的 PDI 为 0.23 ± 0.003 。对于 CD 分析缓冲液中的 mRNA疫苗样品,Z 平均流体动力学直径为 784.9 &#197; + 22.9 &#197; (1σ),对应的纳米级为78.49 nm,相应的 PDI 为 0.19 ± 0.007。两组数据均提示,研究者制备得到了纳米级别的LNP,且粒径分布均匀。
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]图1: 基于DLS法检测mRNA-LNP粒径
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]耀海质量研究平台基于DLS建立了LNP粒径分析方法,该方法具有很好的重复性。从DLS检测图可以看出,mRNA-LNP粒径分布曲线为单峰,且分布集中。粒径及分数系数具体数值分布为:Z-Average为88.87nm,PDI为0.043,均可达到市面高水平。
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]此外,耀海RNA平台交付的多个mRNA-LNP样品检测结果显示,我们的平台工艺下,LNP成品包封效率大于90%粒径可控制在80-100 nm,粒度分布均匀(PDI<0.10)详情可咨询菌菌:13380332910(微信同号)
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]耀海mRNA业务详情: 耀海生物重磅推出mRNA科研级样品定制合成一站式解决方案
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]图2:基于DLS法检测mRNA-LNP粒径(耀海平台)
三、结论1965年,科学家首次发现脂质体的双层结构,这一与细胞膜骨架一致的结构特征推动了其应用于药物递送领域的发展。1978年,人们首次使用脂质体将mRNA递送至细胞中,成功实现蛋白表达。自此之后,阳离子脂质、可电离脂质、固体脂质纳米颗粒(SLNs)、纳米结构脂质体(NLCs)等各种类型的脂质广泛用于核酸递送载体的开发。至 2018年,FDA批准第一款siRNA药物上市,该药物采用包含可电离脂质的脂质纳米颗粒(LNP)递送系统,支持了LNP递送RNA药物的安全性和可靠性。2020年新冠疫情爆发,基于mRNA-LNP技术的新冠疫苗的安全性在大规模人群中得到了验证。颗粒大小是mRNA-LNP的关键质量属性,对药物载荷、稳定性、生物分布、细胞摄取、内吞溶解释放、免疫反应等方面具有重大影响。因此,开发稳健可靠的粒径分析方法,有利于满足多批次mRNA生产需求下产品质量的一致性。整体来看,动态光散射法(DLS)作为mRNA-LNP粒径检测的一种解决方案,具有快速、重复性好、准确性高的优势。因此,国内外法规均推荐使用动态光散射(DLS)用于mRNA-LNP平均粒径及粒径分布的检测。耀海生物质量研究服务平台,目前已具备针对30多种mRNA原液或LNP制剂成品质量属性的方法开发和检测能力。检测项目覆盖质粒纯度、超螺旋比例、浓度、杂质;mRNA原液完整性、加帽率、poly A尾分布、以及模板DNA、双链RNA(dsRNA)、T7 RNA聚合酶、加帽酶、2-O-甲基转移酶、DNAase I、内毒素、抗生素等工艺或产品相关残留;LNP-mRNA成品包封率、粒径、Zeta电位、LNP组分与含量,可为 mRNA 疫苗与药物研发提供更准确、更快速、更灵敏的分析检测,全面满足客户项目研发需求。详情可咨询菌菌:13380332910(微信同号)
参考文献
[1] Myatt DP, Wharram L, Graham C, et al. Biophysical characterization of the structure of a SARS-CoV-2 self-amplifying RNA (saRNA) vaccine. Biol Methods Protoc. 2023 Feb 14;8(1):bpad001. doi: 10.1093/biomethods/bpad001. [2] 药品审评中心. 新型冠状病毒预防用mRNA疫苗药学研究技术指导原则(试行). 2020.[3] WHO. Evaluation of the quality, safety and efficacy of messenger RNA vaccines for the prevention of infectious diseases: regulatory considerations. 2021.[4] USP. Analytical Procedures for mRNA Vaccines–Draft. 2023.
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发表于 2023-10-11 11:17:24 | 显示全部楼层
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