[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]注:本文不构成任何投资意见和建议,以官方/公司公告为准;本文仅作医疗健康相关药物介绍,非治疗方案推荐(若涉及),不代表耀海生物立场。任何文章转载需得到授权。 mRNA的帽结构可维持体内稳定性,促进蛋白的翻译。加帽率是mRNA疫苗或药物的关键质量指标,带帽结构的mRNA占比可影响mRNA的免疫原性和翻译效率。
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]本期文章菌菌将分享基于RNase H的mRNA加帽率检测方法,涵盖探针设计、酶切处理(前处理)、基于LC-MS的寡核苷酸分析。菌菌主要参考了CDE、WHO指导原则,以及美国药典USP推荐的质量检测项和分析方法。 一、mRNA质量分析相关法规目前mRNA技术的应用仍处于科学前沿,在开发和生产过程中mRNA质量相关的监管法规和行业标准处于快速发展阶段。NMPA、WHO和USP均发布了关于mRNA检测项和分析方法开发的规范,建议对DNA原材料、mRNA原液和LNP制剂进行全面的检测放行,从而保证工艺的稳定性和终产品质量的均一性。其中质粒模板的分析方法开发和检测技术已经趋于成熟,菌菌在此不过多阐述。mRNA原液的质量检测项包括:mRNA含量和鉴别、完整性、加帽率、poly A尾分布,以及模板DNA、双链RNA(dsRNA)、T7 RNA聚合酶、加帽酶、2-O-甲基转移酶、DNAase I、内毒素、抗生素等工艺或产品相关残留。[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]mRNA-LNP制剂的质量检测项包括:mRNA鉴别和完整性、LNP-mRNA包封率、纳米颗粒粒径及多分散系数(PDI)、LNP各组分鉴别及含量等。 二、mRNA加帽率检测加帽率是mRNA疫苗或药物的关键质量指标。加帽与未加帽的mRNA仅相差一个核苷酸(m7G),相对于一千至几千碱基的完整mRNA序列来说占比过小,难以区分。当前已建立的加帽率检测思路为:采用酶切方式(RNase H或核酶)获得5’端加帽或不加帽的寡核苷酸序列,随后对不同大小的寡核苷酸片段进行分离与相对定量分析,方法包括尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(尿素变性PAGE)、高效液相色谱(HPLC)、液相质谱联用(LC-MS)或毛细管电泳(CE)等,从而定量分析mRNA的加帽率。[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]其中较为成熟的一种加帽率分析方法为:设计特异性探针并使用RNase H进行酶切处理,然后通过高分辨LC-MS鉴别不同长度的寡核苷酸。 2.1 探针设计mRNA探针的设计主要参考H Inoue等发表的文献《Sequence-specific cleavage of RNA using chimeric DNA splints and RNase H》。菌菌前期对这篇文章进行了详细解读,点击连接即可查看:mRNA加帽率检测中RNase H切割探针的设计研究人员以9个核糖核苷酸组成的RNA链[5’-32P]pACUUACCUG作为目标序列,设计与其互补配对的寡核苷酸杂交链,当寡核苷酸杂交链包含互补的脱氧核糖核苷酸(短DNA序列)和2’-O-甲基修饰的核糖核苷酸(短RNA序列)时,[5’-32P]pACUUACCUG中可被RNase H特异性识别并切割,识别位点在短DNA序列对应的互补序列中。3’-m(UG)-d(AATG)-m(GAC)-5’作为杂交链时,*pACUUACCUG在C6和C7之间被切割,生成*pACUUAC。3’-m(UGAA)-d(TGGA)-m(C)-5’作为杂交链时,RNase H对*pACUUACCUG的切割位点主要在U8和C9之间,生成*pACUUACCU。[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]探针由2’-O-甲基修饰的短RNA序列和4-6个短DNA序列组成,RNase H无法识别2’-O-甲基修饰的RNA序列,但探针5’端的短DNA序列会引导RNase H在与其互补配对的RNA序列的特定位置进行切割。根据该文章对RNase H切割探针的设计思路, mRNA加帽率检测中RNase H切割探针的设计原则如下: a)探针序列由短RNA序列和短DNA序列嵌合而成,与目标RNA链互补配对;b)切割位点由4-6个脱氧核糖核苷酸组成(短DNA序列);c)其余核苷酸均由2’-O-甲基化的核糖核苷酸组成(甲基化的短RNA序列);d)出于产物纯化的考量,3’端标记生物素。 [color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]图1: 嵌合双链的设计与RNase H切割位点 2.2 酶切处理据2016年诺华公司Beverly M等在发表的一篇文章《Label-free analysis of mRNA capping efficiency using RNase H probes and LC-MS》描述,设计并合成探针后,需要进行酶切处理,以获得LC-MS检测样品。具体步骤包括:退火、磁珠结合、RNase H酶切、以及mRNA 5’端寡核苷酸的磁珠纯化。退火反应。反应体系包括500 pmol RNase H探针(生物素标记)、10×RNase H缓冲液和100 pmol mRNA,使用5倍量的探针以保证全部mRNA与探针结合,500 pmol是与磁珠结合的的探针最大量。反应条件为:将探针与mRNA混合,在95℃退火5 min,随后以2 min的间隔降至65℃、55℃、40℃,最后降至22℃。[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]磁珠结合、酶切与纯化。①结合:将退火的mRNA和探针加入预处理过的链霉亲和素磁珠中,室温孵育30 min。加入50 U RNase H,吹打混匀后在37℃下孵育3小时,然后置于磁力架,弃上清。②清洗:用含1M NaCl的清洗缓冲液(5mM Tris-HCl, 0.5mM EDTA, pH7.5)洗涤3次以去除酶、mRNA和反应缓冲液;然后用蒸馏水洗涤3次以除去过量的盐。③洗脱:加入75%甲醇(80℃预热),于80℃孵育1 min洗脱mRNA酶切片段。④换液:通过旋转蒸发干燥洗脱产物,重悬于含1%甲醇的0.1 mM EDTA溶液,用于LC-MS分析。  [color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]图2: 基于RNase H与磁珠,mRNA 5’端寡核苷酸的捕获 2.3 LC-MS分析寡核苷酸药物极性较大,在常规的反相色谱条件下保留较弱,需要在流动相中添加离子对试剂。目前较常用的混合离子对试剂主要包括三乙基乙酸铵(TEAA)、三乙胺-六氟异丙醇(TEA-HFIP)、三乙胺/丙胺-乙酸盐(TEA/PA-AA)以及N-乙基二异丙胺-六氟异丙醇(DIPEA-HFIP)等。详情可查看:高分辨质谱在寡聚核苷酸药物质量研究方面的应用之离子对试剂的选择LC-MS分析。Beverly M等使用液相高分辨质谱联用仪,固定相为ACQUITY UPLC C18色谱柱,流动相A为200 mM六氟异丙醇+8.15 mM三乙胺(pH 7.9),流动相B为100%MeOH。洗脱条件为:5%B洗脱1min,1-12 min内B浓度由5%线性增加到25%,然后90%B冲洗1min后恢复5%B。紫外波长设置为260 nm。[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]LC-MS分离效果。与含有二磷酸、三磷酸或未甲基化G cap(GpppG)相比,含有甲基化M7GpppG帽结构的切割片段,其质量差异有助于加帽率的鉴定。如图所示,借助反相色谱柱进行液相-质谱分析,可有效分离Cap 1与未加帽的三磷酸mRNA切割片段。除预期的寡核苷酸片段外,还存在RNase H第二个识别位点及生物素探针,生物素探针的出现可能是由于洗脱条件苛刻。 [color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]  [color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]图3: 基于RNase H的加帽率分析. 上图为总离子色谱图; 下图为电喷雾质谱. 结合mRNA分析方法学相关法规和文献,我们分享了一种定量分析mRNA加帽率的方法。该分析方法基于链霉亲和素磁珠特异性捕获生物素标记的探针,mRNA 5’端序列与探针结合,从而被RNase H识别并切割,经过清洗、洗脱得到mRNA 5’端单链寡核苷酸序列。然后通过LC-MS、离子对试剂分离带或不带帽结构的寡核苷酸,从而得出mRNA的加帽率。[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]基于上述方法,菌菌团队建立了mRNA加帽率检测平台,可满足探针设计、酶切处理及LC-MS分析的全流程mRNA加帽率分析。 [color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]  三、结论mRNA技术应用场景广阔,预防性疫苗管线覆盖流感、RSV、CMV、HIV,治疗性疫苗/药物靶点包括肿瘤抗原、抗体、细胞因子、造血因子、干扰素、白介素、酶等。为推动mRNA药物的产业化及临床应用,其质量研究方法是需要攻克的一大难关。在生产工艺开发及GMP生产的同时,需要有完整、灵敏、重复性好的分析方法做支持。耀海生物质量研究服务平台,目前已具备针对30多种mRNA原液或LNP制剂成品质量属性的方法开发和检测能力。检测项目覆盖质粒纯度、超螺旋比例、浓度、杂质;mRNA原液完整性、加帽率、poly A尾分布、以及模板DNA、双链RNA(dsRNA)、T7 RNA聚合酶、加帽酶、2-O-甲基转移酶、DNAase I、内毒素、抗生素等工艺或产品相关残留;LNP-mRNA成品包封率、粒径、Zeta电位、LNP组分与含量,可为 mRNA 疫苗与药物研发提供更准确、更快速、更灵敏的分析检测,全面满足客户项目研发需求。详情可咨询菌菌:13380332910(微信同号)
参考文献 [color=rgba(0, 0, 0, 0.9)][1] Inoue H, Hayase Y, Iwai S, Ohtsuka E. Sequence-dependent hydrolysis of RNA using modified oligonucleotide splints and RNase H.FEBS Lett. 1987;215(2):327–30. [color=rgba(0, 0, 0, 0.9)][2] Beverly M, Dell A, Parmar P, et al. Label-free analysis of mRNA capping efficiency using RNase H probes and LC-MS. Anal Bioanal Chem. 2016 Jul;408(18):5021-30. doi: 10.1007/s00216-016-9605-x. [color=rgba(0, 0, 0, 0.9)][3] 药品审评中心. 新型冠状病毒预防用mRNA疫苗药学研究技术指导原则(试行). 2020. [color=rgba(0, 0, 0, 0.9)][4] USP. Analytical Procedures for mRNA Vaccines–Draft. 2022. [color=rgba(0, 0, 0, 0.9)][5] WHO. Evaluation of the quality, safety and efficacy of messenger RNA vaccines for the prevention of infectious diseases: regulatory considerations. 2021
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