小奕说药 | 非变性条件下的双链siRNA及其杂质在AEX色谱柱中的保留情况

奕安济世生物药

在生物药研发领域，小干扰RNA（siRNA）因其高效、特异的靶基因调控能力，已成为治疗多种疾病的重要工具。然而，siRNA的生产过程中常伴随未配对的单链残留和非完整双链（5’端核苷酸缺失，链断裂，2’,3’-异构化）的形成，这些杂质可能影响药物的安全性和有效性。如何分析这些杂质，一直是质量控制中的难题。与单链的液相色谱分析相比，非变性条件下的双链分析更具有挑战性，因为需要较严苛的色谱条件来维持氢键。一项发表在《Journal of Chromatography A》上的研究为这一问题提供了新的解决思路。

来自大阪大学和日本化学物质评价研究机构的研究团队，通过优化阴离子交换色谱（AEX）的非变性条件，成功实现了对短双链寡核苷酸（约20个碱基对）及其潜在杂质的有效分离。

研究对象

本研究参考已批准的siRNA药物序列设计了一系列核苷酸，均为21个氨基酸的正义链和23个氨基酸的反义链及相应的单链和非完整双链。

表1. RNA1正义链和反义链的寡核苷酸序列

表2. RNA2正义链和反义链的寡核苷酸序列

优化色谱条件

柱温和pH的优化：在非变性条件下分析双链siRNA时，必须避免色谱柱柱温高，pH值高，流动相中有机溶剂含量高等情况，以保持氢键。在保证双链氢键的前提下，对柱温和流动相进行优化。

（1）当柱温升高到60℃时，双链出现宽峰。说明氢键已发生部分断裂。

图1. 不同柱温下的双链siRNA峰型

（2）流动相pH为10.0时，单链出现宽峰。说明氢键已发生部分断裂。

图2. 流动相pH为10.0时的峰型（RNA1 为双链siRNA, RNA1 ss n-1为缺失一个碱基的RNA1 ss链，RNA1 ss n-2为缺失两个碱基的RNA1 ss链，RNA1 ss n-3为缺失三个碱基的RNA1 ss链）

（3）流动相pH为7.0时，反义链与双链的保留时间相近。

图3. pH为7.0时单链和双链的分离

确定色谱条件

使用Thermo的DNAPac PA200 RS(4μm, 4.6*250mm)色谱柱，流动相A为Tris-HCl(20 mM, 使用HCl调节至pH 9.0)，流动相B在流动相A的基础上加入1.25 M的NaCl。柱温30℃，流速0.8 mL/min，15 min流动相B的线性洗脱梯度从30%升至70%。

保留时间影响因素

01 悬垂碱基*长度和悬垂碱基类型对保留时间的影响

（1）碱基减少会导致更强的保留：如RNA2 as n-1比RNA2 减少1个核苷酸， 保留时间更长。

图4. RNA2碱基数量减少，保留增强

（2）RNA1反义链的碱基缺失表现出复杂的保留行为：在缺失U的情况下，保留力减弱，而随着A的缺失，保留力增强。

图5. RNA1反义链碱基缺失复杂的保留行为

（3）保留强度不仅受暴露碱基磷酸盐数目和负电荷的影响，还受缺失碱基位置的影响。

02 流动相pH的影响

研究中性（pH 7.0）与碱性（pH 9.0）条件下，缺失和暴露的碱基类型与流动相pH和保留时间的关系。

（1）在中性流动相（pH 7.0，图6）中，每种双链体的洗脱时间相较于pH 9.0（图7）条件下更为接近。

图6. 流动相pH为7.0时，RNA1缺失序列的色谱分离分析

（2）由于互变异构氧原子的影响，随着流动相pH值的降低，单链的保留变弱。当G和U暴露在pH 7.0时，与pH 9.0相比，对保留强度的贡献程度降低了0.1 min以上。该保留时间缩短现象在暴露C和A碱基时并未出现，因为这两种碱基在pH 7.0-9.0范围内不具备互变异构氧原子特性。

表3. 流动相pH对保留时间的影响

图7. 流动相pH为9.0时，RNA1缺失序列的色谱分离分析

因此pH 9.0的流动相似乎更适合分离完全匹配与非完全匹配的双链体。通过精细调节流动相的pH值，可能进一步提高对某些特定杂质的分离效果。

03 悬垂碱基替换对保留时间的影响

（1）当RNA1反义链3’末端的A替换为其他碱基时，保留行为发生显著变化。在3’末端替换时，洗脱顺序为C < U < A < G，其中C与G的保留时间差异为0.495分钟。在悬垂端碱基替换的根部位置，洗脱顺序为A < G < C < U，A与U的保留时间差异为0.332分钟。

图8. RNA1悬垂碱基替换的保留行为

（2）洗脱顺序随碱基替换位置的变化而改变，与碱基替换出现在悬垂端根部相比，出现在3’末端更有影响力。

（3）当单独考虑嘌呤和嘧啶时，无论替换位置如何，具有互变异构能力的G和U比不带电荷的A和C保留性更强。

04 凸出结构双链对保留时间的影响

已知在单链合成过程中会发生末端缺失和内部碱基缺失。因此，评估从序列中间缺失一个碱基的非理想双链（即凸出结构双链体）与理想双链的分离能力也至关重要。

无论缺失的碱基类型如何，与理想双链体相比，凸出结构双链体均表现出更长的保留时间（图9）。尽管需进一步研究，但碱基的缺失可能导致互补碱基向外翻转，同时使翻转碱基两侧的磷酸二酯键变得灵活，从而增加固定相对磷酸二酯键上磷酸基团的可接触性。

图9. 凸出结构双链体的保留行为

碱性流动相中带悬垂双链寡核苷酸的保留模型

（1）双链的保留力比单链弱，因为单链中G和U碱基上带微弱负电荷的互变异构氧可与离子交换剂相互作用，而双链中的碱基参与形成双螺旋结构，且部分磷酸基团在双螺旋中朝向与固定相带电表面相反的方向。此外，单链结构比双链更灵活，更易与固定相发生相互作用。

（2）若单侧链缺失更多碱基，悬垂端延长，保留通常增强。但单碱基缺失并不总是导致保留时间增加，例如特定位置（本研究中正义链的3'端）暴露出不带电碱基的情况。

（3）悬垂端碱基类型对保留时间存在影响。但各碱基的保留强度会随位置变化而改变。若将嘌呤和嘧啶碱基分开考虑，带负电荷的互变异构碱基倾向于比相应不带电碱基更晚被洗脱。

图10. 带悬垂双链寡核苷酸的保留机制示意图：通过阴离子交换固定相中带正电荷的季铵基团与碱性流动相中带负电荷的磷酸基团及碱基之间的表面电位静电相互作用实现

实际应用与意义

这项研究为siRNA及其类似药物的质量控制提供了重要的分析方法。通过非变性AEX方法，研发人员能够更准确地检测和量化生产过程中的杂质，确保药物的纯度和疗效。此外，研究提出的保留行为模型为未来开发更高效的分析方法奠定了基础。

展望

研究团队表示，未来将进一步探索二维液相色谱（2D-LC）与质谱联用技术，以更全面地表征双链寡核苷酸中的杂质结构。这一方向有望为生物药的研发和质量控制带来更多突破。

结语

随着基因治疗和RNA药物的快速发展，高效、精准的分析方法显得尤为重要。这项研究不仅解决了双链寡核苷酸分析的难题，也为相关领域的质量控制提供了新思路。让我们期待更多创新技术的涌现，推动生物药研发的进步！

*悬垂碱基：指核酸中不参与碱基配对的核苷酸序列，通常位于DNA片段的两端。

参考文献

Hiroyuki Togawa, Takashi Okubo, Yumi Nonaka, et al. Retention behavior of short double-stranded oligonucleotide and its potential impurities by anion-exchange chromatography under non-denaturing conditions [J] Journal of Chromatography A, 2023, 1691: 463808.

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