CRISPR 基因敲除细胞系构建：常见难题与关键步骤全解析

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CRISPR技术的出现，为研究者快速、精准地建立基因敲除（Knockout, KO）模型提供了前所未有的便利。KO 细胞系是揭示基因功能、验证靶点机制、探索药物敏感性的关键工具。但许多研究人员在实际构建 KO 细胞时，却常常遇到低效率、周期长、结果难以验证等困境。

今天以FAQ问答形式带大家系统梳理构建 KO 细胞系过程中最常见的 6 个问题，并在后半部分总结 实验中容易被忽视的关键步骤，帮助大家更高效地完成 KO 项目。同时，我们也将分享如何借助 源井生物的 8000+ KO 现货细胞库和一站式服务，大幅降低实验难度与周期成本。

一、 常见问题 FAQ

1. 我应该选择哪种细胞系来构建 KO？

选择合适的细胞系，是 KO 项目的第一步。理想的细胞系需满足：

l基因组稳定：避免多倍体或复杂拷贝数变化，方便结果解析；

l易于转染或感染：提升 CRISPR 系统递送效率；

l目标基因确实表达：否则无法通过功能验证来确认敲除效果。源井生物自主研发的EZ-editor™基因编辑工具，可以对基因的表达水平进行评估，帮助您降低实验风险。

例如：HEK293T、CHO 等常用细胞，因其转染效率高，是KO入门的首选；原代细胞、iPSC 更贴近生理状态，但基因编辑难度大，需优化策略。

如果你对细胞背景不确定，或时间紧迫，可以直接利用源井生物 8000+ KO 现货细胞库，涵盖常见研究方向基因，现货供应，即拿即用。

2. 为什么很难获得纯合 KO 克隆？

要实现双等位基因同时敲除，在统计学上本身就是低概率事件。例如，单等位基因编辑成功率为50%，则双等位基因同时发生功能性移码的概率不到 25%。再考虑移码效率和修复方式，真正能得到纯合KO的比例可能低于10%。

更复杂的是，如果目标基因是必需基因，完全 KO 的克隆会直接死亡，只能获得部分敲除或杂合的克隆。

解决办法：

l使用多个 sgRNA 靶点，提高编辑几率；源井生物自主研发的基因敲除细胞自动方案系统，可以1分钟内出三套方案，满足不同实验需求。

l筛选更多单克隆（几十到上百个）；

l必需基因可考虑条件性KO或 CRISPRi 替代方案。

l直接找专业的技术服务公司帮忙构建敲除细胞

3. 如何避免 CRISPR 的脱靶效应？

脱靶效应会导致 KO 结果偏差，甚至出现虚假表型。

降低脱靶的策略包括：

lsgRNA 设计：优先选择 CRISPR 评分高、预测脱靶少的靶点序列；

l使用高保真 Cas9

l递送方式：Cas9 RNP（蛋白+sgRNA 复合物）瞬时表达，减少脱靶；

l验证环节：通过 Sanger 测序 + PCR验证，或蛋白水平上的验证如Western Blot。

4. sgRNA 设计有哪些注意事项？

sgRNA 是 KO 成功的关键。设计要点：

l靶点选择：位于早期外显子，且覆盖所有转录本；

lGC 含量：控制在 40–60%，避免极端序列；

l同源性：确保序列唯一，不与其他基因高度相似；

l多靶点策略：同时设计多个 sgRNA，比较效率后再筛选最优者。

l工具推荐：CRISPick、CHOPCHOP、CRISPOR、源井生物基因敲除细胞自动方案系统等。

5. 如何提升 CRISPR 系统的递送效率？

转染/递送效率直接决定敲除成功率。

l常规细胞（如 HEK293）：脂质体或电转染即可；

l难转染细胞（如免疫细胞、原代细胞）：更适合电转或慢病毒；

l优化思路：调节细胞密度、Cas9 与 sgRNA 比例，选择合适的培养条件。

在实际研究中，许多科研人员会先用 荧光对照（EGFP） 预实验来评估递送成功率，再正式开展编辑实验。

6. 如何筛选和验证 KO 克隆？

CRISPR 实验成功后，并不代表你已经得到 KO 细胞，还需经过：

l群体检测：T7E1或测序，评估编辑效率；

l单细胞克隆化：稀释法或 FACS 分选；

l基因型鉴定：PCR+测序，确认是否为纯合 KO；

l蛋白水平验证：Western blot、免疫荧光；

l功能验证：结合下游实验确认表型。

如果你不想在繁琐的测序分析中花费大量时间，可以直接使用源井生物EZ-editorTM Genotype Analysis System(GAS)，只需上传数据，即可快速拆解测序结果，并获得可视化图表。

容易被忽视的关键步骤

在 CRISPR KO 项目中，以下几个步骤经常被忽略，却是成败关键：

1. sgRNA 筛选实验：不要盲信计算机预测，务必在小规模实验中验证 sgRNA 效率；

2. 转染条件优化：不同细胞对转染试剂、电压等敏感度差异很大；

3. 足量单克隆筛选：至少扩增 50–100 个单克隆，才能增加找到纯合 KO 的概率；

4. 全面的验证手段：基因型测序 + PCR验证 + 功能实验三重验证，确保 KO 的可靠

5. 考虑基因必需性：若目标基因必需，需提前设计替代策略（条件性 KO、CRISPRi）。

源井生物的 KO 解决方案

如果你也遇到过以下困境：

l 整个 KO 项目耗时数月，却仍未获得合格克隆；

l 难转染的细胞系始终无法优化成功；

l 单克隆筛选与验证消耗大量人力；

那么，源井生物可以为你提供更省心的方案：

l 8000+ KO 现货细胞库：即买即用，覆盖常见基因与细胞系；

l 定制化KO服务：包括 sgRNA 设计、转染优化、筛选与验证，一体化的KO细胞构建服务；

l 红棉 · CRISPR基因编辑系统：一分钟可以提供三套敲除方案

l 完善售后支持：实验指导 + 结果解读，全程技术支持。

让你在更少的细胞量、更短的周期、更低的成本下，快速进入功能研究阶段。

总结

CRISPR KO 细胞系的构建是一项需要耐心和细节把控的系统工程。只有在 sgRNA 设计、递送优化、克隆筛选与验证等环节做到精细化与系统化，才能获得真正可靠的 KO 模型。而借助 源井生物的现货细胞库与一站式服务，则能帮助你规避冗长的构建周期和反复的技术尝试，直接把精力集中在科研创新与成果产出上。

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学习了，谢谢提供分享。