药品检验中细菌内毒素检查（凝胶法）方法学研究 ----凝胶法试验中注意的问题（二）

沁人绿茶.

药品检验中细菌内毒素检查（凝胶法）方法学研究
----凝胶法试验中注意的问题（二）         鲎试验法检测细菌内毒素是由1968 年美国科学家Levin 和Bang建立，中国药典1995 年版开始收载了12 种药品细菌内毒素检查，此后化药绝大部分品种质量标准中的热原检查（兔法）逐渐被细菌内毒素检查法所取代。近几年，我室承担药品细菌内毒素方法标准复核工作较多，同时也发现了一些生产企业存在的问题，有些企业或检验员对方法的理解不够清楚，对限值制定存在较低情况等，下面我就工作中遇到的问题做以具体总结：          1. 供试品细菌内毒素限值的确定         药品细菌内毒素检查是一种限度试验, 首先必须确定供试品的细菌内毒素限值。新药细菌内毒素检查限值（L）的确定是整个方法学建立的前提和基础，现在一般按照《中国药典》2010 版二部附录XI E 进行确定。计算公式为L=K/M，K 为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/（kg•h）表示，非放射性注射剂K=5EU/（kg•h），放射性注射剂K=2.5EU/（kg•h），鞘内用注射剂K=0.2 EU/（kg•h）；M 为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，成人体重按60kg计算，体表面积为1.62 m2。部分抗肿瘤药物及抗生素的使用剂量以体表面积描述时，可将每平方米体表面积剂量乘以0.027，即可转换为每千克体重剂量。         在L值确定时如遇到多种途径给药或不同年龄人群（儿童、老人）等临床使用剂量不一致时，需综合考虑，找出最大给药剂量。 举例说明：药品名称：注射用比伐卢定；规格：每瓶含250mg比伐卢定；用法用量：比伐卢定推荐剂量：首剂按0.75mg/kg静脉推注，继以1.75mg/kg/h的速率在整个PCI过程期间持续静脉输注。在肾功能损害患者中比伐卢定的剂量可能要降低，中度肾功能损害患者（30-59ml/min）比伐卢定剂量为1.75mg/kg/h。如果肌酐清除率小于30 ml/min，应考虑将剂量减少至1.0 mg/kg/h滴注速率。         根据上述说明书用法用量描述计算可得，本品临床最大给药剂量2.5mg/kg/h（首剂按0.75mg/kg静脉推注，继以1.75mg/kg/h滴注）”为L=K/M=5EU/（kg•h）/2.5mg/（kg•h）=2EU/mg。《化学药品注射剂安全性检查法应用指导原则》规定，“由于药物和适应症（如抗感染、抗肿瘤、心血管等急重病症用药、儿童老人用药、复合用药、大输液等）的不同，限值可适当严格，至计算值的1/3～1/2，以保证安全用药。”故注射用比伐卢定品种细菌内毒素检查限值设定应小于1.0EU/mg即为合理。         2 鲎试剂灵敏度复核试验         2.1 前期准备工作         试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。耐热器皿常用干热灭菌法（250℃，30 min 以上）去除。需要特别说明的是，玻璃容器洗涤时需使用合格的蒸馏水反复冲洗三遍以上，以免影响后续试验结果。         2.2 灵敏度复核试验         当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。需要注意的是，当实测灵敏度λc 在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ～2.0λ，λ为鲎试剂灵敏度的标示值）时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度，日常检验中部分检验者误将实测的灵敏度作为批鲎试剂的灵敏度来进行常规检查或干扰试验。         3 干扰试验         当进行新药的内毒素检查试验前或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试验；当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。         3.1 最大有效稀释倍数（MVD）的确认         MVD 是指在试验中供试品溶液被允许达到稀释的最大倍数，计算公式为MVD=C•L/λ，式中L 为供试品的内毒素限值，λ 为鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml），或是在光度测定法中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度；C 为供试品液的浓度，当L 以EU/ml 表示时，则C 等于1.0；如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD 取1，可计算供试品的最小有效稀释浓度C=λ/L。此处往往根据市售主要的鲎试剂灵敏度范围（0.03～0.5 EU/ml）来计算干扰试验中的有效浓度稀释范围。          3.2 干扰预试验          取供试品1 支（原料精密称取不低于10 mg），按照拟定内毒素限值，原料或注射用粉针加内毒素检查用水溶解并稀释至不低于MVD 规定的系列浓度，注射液直接稀释至不低于最小有效稀释浓度的系列浓度，预试验时选取两个不同厂家灵敏度为0.25EU/ml 或0.5EU/ml的鲎试剂，对供试品原液及其系列稀释液（供试品阴性对照）进行干扰检验。另外设立阳性对照、阴性对照、供试品阳性对照，每个浓度平行做两管，最终得出供试品在某浓度及以下浓度对鲎试验检查不产生干扰作用的结论。          3.3 正式干扰试验        《中国药品检验标准操作规范》2010年版细菌内毒素检查法建立的指导原则中规定：注射用药品、生物制品建立细菌内毒素检查方法时，为验证不同样品和不同鲎试剂反应的一致性，要求同时使用两个鲎试剂厂家的鲎试剂对每个品种至少三批样品（如为上市品种应检测两个以上生产厂家的样品，如为新药需检测连续生产的样品）进行干扰试验。对正式干扰试验的结果评价规定，只有当供试品溶液和阴性对照溶液的平行管都为阴性，且鲎试剂标示灵敏度的对照系列溶液的结果在鲎试剂灵敏度范围内时，试验方为有效，计算系列鲎试剂标示灵敏度的对照系列溶液和干扰试剂系列溶液的反应终点浓度的几何平均值（Es 和Et）。当Es 在0.5λ～2.0λ 及Et 在0.5Es～2.0Es 时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD 的进一步稀释，再重复干扰试验。另外，在正式干扰试验中建议使用较低灵敏度（0.25EU/ml 或0.5EU/ml）的鲎试剂，如某品种在建立方法时使用灵敏度为0.125 EU/ml或0.06 EU/ml鲎试剂进行干扰试验合格，不建议该品种质量标准制定建立细菌内毒素检查项。          近期在检验工作中发现，部分生产企业或仅应用一个厂家的鲎试剂（安度斯）或仅针对一批产品进行干扰试验，这种情况的发生直接影响细菌内毒素检查标准的制定。我们本着“和谐、开放、专业、高效”的所训为企业服务，作为技术人员提示生产企业和相关检验人员严格按照方法规定执行，以免造成产品生产或审批程序延迟。

来自辽宁省药检所。

酋长

预干扰试验，记得CP中没有特别提出过，我们这边有次过FDA，陪同人员曾也曾建议把预干扰试验删了，个人感觉预干扰试验挺好的，至少方法验证的时候鲎试剂省了不少..{:soso_e113:}

善变的云

挺不错的资料，谢谢分享

YFCHLH

学习了，谢谢。

彩虹

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消逝的风

学习到了，谢谢楼主了，辛苦了

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路过学习了

hq2346

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