药典委：生物制品企业请对氰化物检查法拟新增方法进行扩大再验证

沁人绿茶.

转自：国家药典委 编辑：水晶

5月30日，国家药典委发布通知，药典委设立了生物制品氰化物残留量检查法补充方法的研究课题，现形成了自动化程度更高、灵敏度更高的氰化物残留量检查法草案。现阶段需要相关企业对该方法进行扩大再验证，并提供相关意见。

本草案在目前0806氰化物检查法的基础上进行修订，新增1.连续流动注射+直流安培法、2.连续流动注射+光度法、3.流动注射+光度法作为第四法。

主要分为三部分，包括原理、设备、试剂、仪器参数的设置；对照品溶液、供试品溶液的制备；系统适用性要求、测定法、结果计算，并在附注里提出了其他需要关注的问题。



各有关单位：  

为进一步提升《中国药典》生物制品标准的科学性，更好地保障生物制品质量，我委设立了氰化物残留量检查法补充方法的研究课题。该课题已由四川省药品检验研究院承担完成起草工作，并经上海市食品药品检验研究院完成复核工作，形成了自动化程度更高、灵敏度更高的氰化物残留量检查法草案。现阶段需要相关企业对该方法进行扩大再验证，并提供相关意见。请于2024年7月15日前将反馈意见表电子版（见附件2）和氰化物检查法测定结果汇总表（见附件3）发送至指定邮箱。  

联系人：四川省药品检验研究院张姮婕  

联系电话：13880070757  

联系邮箱：1366009743@qq.com  

附件：  

附件1.氰化物检查法（第四法）草案.docx  

附件2.氰化物检查法（第四法）起草说明.docx  

附件3.氰化物检查法（第四法）反馈意见表.xlsx  

附件4.氰化物检查法（第四法）测定结果汇总表.docx  

氰化物检查法(第四法)草案  

第四法  

1.连续流动注射+直流安培法  

原理通过超滤对样品进行前处理，以去除大分子物质。去除大分子物质后的样品溶液与酸性试剂混合，经连续流动注射分析仪进行在线紫外消解，将待测的总氰化物（溴化氰、氰基硼氢化钠等）转化成氰化氢。氰化氢通过气体扩散膜扩散到碱性溶液中，并在碱性溶液中转化为氰根离子。然后将氰根离子带入直流安培检测器。其中，氰根离子与银/氯化银的参考电极发生配位交换，产生的电流与测量样品的总氰化物浓度成正比。检测器响应显示为峰高。由此产生的峰值高度与样品中的总氰化物浓度成正比，最后通过标准曲线法得到样品溶液中总氰化物的残留量。  

设备连续流动注射分析仪：自动进样器、多通道蠕动泵、总氰化物分析模块、紫外消解器、膜分离器、直流安培检测器、数据处理系统。  

试剂（1）含2%次磷酸的1mol/L硫酸溶液：取硫酸55mL，缓缓注入适量水中，冷却至室温，加次磷酸20mL，加水稀释至1000mL，摇匀，即得。  

（2）0.1mol/L氢氧化钠溶液：取澄清的氢氧化钠饱和溶液5.6mL，加水使成1000mL，摇匀，即得。  

（3）水。  

对照品溶液的制备（1）500ng/mL对照品贮备液取水中氰成分分析标准物质（50μg/mL），用水稀释成含氰化物浓度（以CN-计）为500ng/mL的溶液。  

（2）对照品溶液精密量取500ng/mL对照品贮备液适量，用水逐级稀释成含氰化物浓度（以CN-计）分别为1.25、2.5、5、10、20、40、60、80ng/mL的溶液。  

（3）灵敏度溶液精密量取500ng/mL对照品贮备液适量，用水逐级稀释成含氰化物浓度（以CN-计）为1.25ng/mL的溶液。  

供试品溶液的制备取供试品2mL，置3KD超滤离心管中，加0.1mol/L氢氧化钠溶液1mL，以每分钟4000×g离心45分钟（采用水平转头）或每分钟7500×g离心45分钟（采用固定转头）后，再加水1mL，自“以每分钟4000×g离心45分钟（采用水平转头）或每分钟7500×g离心45分钟（采用固定转头）”起，重复操作两次，离心结束后合并滤液，混匀，即得。  

仪器参数的设置一般参考条件：进样时间为35s；进样体积为200μL；40%泵速；样品周期时间为160s；紫外波长为312nm；直流安培检测器。  

系统适用性要求灵敏度溶液色谱图中，主成分峰峰高的信噪比应大于10。  

测定法将酸性试剂管路插入含2%次磷酸的1mol/L硫酸溶液中，将碱性试剂管路插入0.1mol/L氢氧化钠溶液中，将载液管路插入水中。开启蠕动泵，让溶液流经整个系统，待基线平稳后，分别取对照品溶液、供试品溶液注入全自动化学分析仪，记录峰高。  

结果计算以对照品溶液中氰化物浓度（以CN-计）（ng/mL）对其相应的峰高作线性回归，求得线性回归方程，将供试品溶液的峰高带入线性回归方程，求得供试品溶液中氰化物浓度（以CN-计）B（ng/mL），再通过换算得出供试品中氰化物浓度（以CN-计）（ng/mL），最后除以多糖含量（mg/mL）得到供试品中氰化物残留量（ng/mg）。  

计算公式为：  

供试品中氰化物残留量（ng/mg）=（B×稀释倍数）/多糖含量  

2.连续流动注射+光度法  

原理本法仍以超滤对样品进行前处理，以去除大分子物质。去除大分子物质后的样品溶液，在酸性条件下，通过在线蒸馏释放出氰化氢。氰化氢通过膜分离器分离，然后被碱性溶液吸收变成氰根离子。在弱酸性条件下，氰根离子与氯胺T反应生成氯化氰，再与异烟酸反应经水解生成戊烯二醛，戊烯二醛与巴比妥酸缩合生成紫蓝色化合物，于波长600nm处进行比色测定。  

设备连续流动分析仪：自动进样器、多通道蠕动泵、氰化物反应单元、蒸馏模块、膜分离器、600nm比色检测器、数据处理系统。  

试剂（1）蒸馏试剂：取枸橼酸50g，加水800mL使溶解，加氢氧化钠12g，加水稀释至1000mL，用1mol/L的盐酸溶液或1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至3.8。  

（2）0.1mol/L氢氧化钠溶液：取澄清的氢氧化钠饱和溶液5.6mL，加水使成1000mL，摇匀，即得。  

（3）30%十二烷基聚乙二醇醚溶液：取十二烷基聚乙二醇醚（（C2H4O）nC12H26O）30g，加水50mL，在70℃下搅拌至充分溶解，放冷，加水使成100mL，即得。  

（4）缓冲溶液（pH5.2）：取氢氧化钠2g与邻苯二甲酸氢钾20.5g，加水1000mL使溶解，用1mol/L的盐酸溶液或1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至5.2，加试剂（3）1mL，摇匀，即得。  

（5）氯胺T溶液：取氯胺T2g，加水1000mL使溶解，即得。  

（6）异烟酸-巴比妥酸试剂：取氢氧化钠7g、二甲基巴比妥酸（C6H8O3N2）16.8g与异烟酸（C6H5NO2）13.6g，加水1000mL使溶解，用1mol/L的盐酸溶液或1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至5.2，即得。  

对照品溶液、灵敏度溶液、供试品溶液的制备见1.连续流动注射+直流安培法项下。  

仪器参数的设置一般参考条件：蒸馏模块温度为125℃，检测波长为600nm。其余见1.连续流动注射+直流安培法项下。  

系统适用性要求见1.连续流动注射+直流安培法项下。  

测定法按照仪器说明，依次将指定管路放入对应的溶液中，并按照最佳工作参数进行仪器调试，待基线平稳后，分别取对照品溶液、供试品溶液注入全自动化学分析仪，记录吸光度。  

3.流动注射+光度法  

原理本法样品前处理、化学反应原理与2.连续流动注射+光度法相同，仅是样品分析方式不同：连续流动分析是利用连续流、通过蠕动泵将样品和试剂泵入分析模块中混合、反应，并泵入气泡将流体分割成片段，使反应达到完全的稳态后，进入检测器进行测定。流动注射分析是在封闭的管路中，将一定体积的样品注入连续流动的载液中，样品与试剂在化学反应模块中按特定的顺序和比例混合、反应，在非完全反应的条件下，进入检测器进行测定。  

设备流动注射分析仪：自动进样器、多通道蠕动泵、氰化物反应单元、蒸馏模块、膜分离器、600nm比色检测器、数据处理系统。  

试剂（1）蒸馏试剂：取磷酸50mL，加水稀释至1000mL，即得。  

（2）0.025mol/L氢氧化钠溶液：取澄清的氢氧化钠饱和溶液1.4mL，加水使成1000mL，摇匀，即得。  

（3）磷酸盐缓冲溶液（pH4.0）：取磷酸二氢钾97g，加水1000mL使溶解，即得。  

（4）氯胺T溶液：取氯胺T2g，加水500mL使溶解，即得。  

（5）异烟酸-巴比妥酸试剂：取氢氧化钠12g、二甲基巴比妥酸（C6H8O3N2）16.8g与异烟酸（C6H5NO2）13.6g，加水1000mL使溶解，即得。  

对照品溶液、灵敏度溶液、供试品溶液的制备见1.连续流动注射+直流安培法项下。  

仪器参数的设置见2.连续流动注射+光度法项下。  

系统适用性要求见1.连续流动注射+直流安培法项下。  

测定法按照仪器说明，依次将指定管路放入对应的溶液中，并按照最佳工作参数进行仪器调试，待基线平稳后，分别取对照品溶液、供试品溶液注入全自动化学分析仪，记录吸光度。  

【附注】（1）不同品牌或型号仪器的试剂配制有所不同，可根据试剂情况进行调整，经完整的方法学验证后使用。  

（2）当采用光度法进行测定时，供试品溶液的吸光度读数，以在0.3-0.7之间为宜。  

（3）应注意仪器管路系统的保养，经常清洗管路；每次实验前都应检查泵管是否磨损，并及时更换已损坏的泵管。  

（4）供试品溶液超滤完成后，膜上液体应不大于100μL，若剩余较多，可延长超滤时间。  

（5）供试品溶液需当日配制，当日使用。  

（6）可用0.01mol/L溶液氢氧化钠代替水制备对照品溶液。  

氰化物检查法（第四法）起草说明  

一、修订目的  

目前各国药典逐渐由传统化学检查法向现代仪器分析法转变，因此，0806氰化物检查法新增：1.连续流动注射+直流安培法、2.连续流动注射+光度法、3.流动注射+光度法作为第四法。推荐使用第1法。  

此外，为解决溴化氰对照品剧毒且不易购买的问题，增加用水中氰成分分析标准物质制备对照品溶液的方法；为解决疫苗中蛋白质等大分子物质对检测结果的干扰，增加对样品进行超滤的前处理方法。  

二、修订思路  

本草案在目前0806氰化物检查法的基础上进行修订，新增1.连续流动注射+直流安培法、2.连续流动注射+光度法、3.流动注射+光度法作为第四法。主要分为三部分，包括原理、设备、试剂、仪器参数的设置；对照品溶液、供试品溶液的制备；系统适用性要求、测定法、结果计算，并在附注里提出了其他需要关注的问题。  

三、主要内容  

（一）原理、设备、试剂、仪器参数的设置  

本部分内容由调研市面上主流仪器结合具体实验结果汇总得出。通过不同厂家型号间的仪器试验对比结果，明确了方法的试剂配制方法，并详细列出了各仪器参数，提供指导性意见。  

（二）对照品溶液、供试品溶液的制备  

本部分分为对照品溶液的制备、供试品溶液的制备两部分内容。对照品选用国家标准物质：水中氰成分分析标准物质（标准物质编号：GBW（E）080115；中国计量科学研究院）在对照品溶液中，参考色谱法增订了灵敏度溶液的制备方法。  

（三）系统适用性要求、测定法、结果计算  

氰化物检查属于痕量分析，为更好的评价色谱系统检测痕量物质的能力，参考《中国药典》2020年版高效液相色谱法（通则0512）及离子色谱法（通则0513）中系统适用性要求，设置了灵敏度溶液来评价色谱系统的检测能力。此外，当采用光度法（即本草案所述第2小法及第3小法）进行测定时，参考《中国药典》2020年版紫外-可见分光光度法（通则0401）中相关要求，供试品溶液的吸光度读数应在0.3-0.7之间。因疫苗中氰化物残留量高低不一，本草案采用了标准曲线法。在结果计算公式中明确了氰化物浓度（ng/mL）与供试品中氰化物残留量（ng/mg）的换算关系。  

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