色谱分析方法验证

zhangjun1

一、先说关键点（归一化法与“准确度”的关系）

面积归一化法默认各峰响应因子相同（RRF≈1），用各峰面积占总面积的百分比表示含量（不含溶剂/系统峰）。

因此，准确度验证的核心不只是“回收率”，更重要的是要：

证明**主要已知杂质的相对响应因子（RRF）**与主成分接近、在可接受范围内；

通过加标回收或配比混合物（重配比），验证“理论百分比”与“实测归一化百分比”的一致性。

如果某些已知杂质的 RRF 与 1 偏差较大（如超出 0.8–1.2），就不适合用纯面积归一化法，应引入 RRF 修正或外标法。

二、准确度验证的适用范围与层级

验证范围（Range）：从报告阈值（Reporting Threshold）到规定限度（Specification Limit）的 120–150%。
例：限度为 0.10%（w/w），可在 0.05%、0.10%、0.15%（或 0.12%） 这 3 个梯度做准确度。

对象：

已知/有对照品的杂质：逐一评估。

无对照品的未知杂质：可用代表性杂质或应力降解样品进行“总有关物质”的回收/质量平衡（mass balance）佐证准确度。

三、前提工作：RRF 的确认（强烈建议）

制备对照：分别配制主成分（API）与每个已知杂质的标准溶液（相近浓度）。

测峰面积：在相同进样量下测得 A(API)、A(Imp i)。

计算 RRF：

R
R
F
𝑖
=
(
𝐴
I
m
p

𝑖
/
𝐶
I
m
p

𝑖
)
(
𝐴
A
P
I
/
𝐶
A
P
I
)
RRF
i
        ​

=
(A
API
        ​

/C
API
        ​

)
(A
Impi
        ​

/C
Impi
        ​

)
        ​


判定：RRF_i 在 0.8–1.2（±20%） 以内通常可接受（企业可自定更严格标准，如 0.9–1.1）。

若不满足，归一化法将带来系统偏差：要么把该杂质从归一化法中排除，改用 RRF 修正或外标定量；要么在 COA 中声明方法学限制。

小结：RRF 符合要求后，再做下面的“准确度”才有意义；否则“回收率”好也可能是偶然抵消的结果。

四、准确度的两种做法（任选其一，或两者结合）
A. 加标回收法（Spiking Recovery） —— 最常用

场景：拿到杂质对照品的情况。

步骤

基质选择：优选样品溶液（含主成分、真实基质），或空白基质/安慰剂+API模拟样品。

加标水平（对每个已知杂质）：

低：≈ 报告阈值（如 0.05%）

中：= 规限（如 0.10%）

高：= 规限的 150%（如 0.15%）
每一水平至少 3 份平行。

进样并用面积归一化得到每个杂质的归一化百分比：

%
𝐴
𝑖
=
𝐴
𝑖
∑
𝐴
（主峰+杂质峰）
×
100
%A
i
        ​

=
∑A
（主峰+杂质峰）
        ​

A
i
        ​

        ​

×100

理论值的确定

如果 RRF≈1（已确认），理论“归一化百分比”≈ 加标质量百分比（w/w）（因总量≈100%，误差可忽略）。

若有微小差异，可按下式更严谨换算：

%
𝐴
𝑖
,
t
h
e
o
≈
𝐶
𝑖
⋅
R
R
F
𝑖
𝐶
A
P
I
⋅
R
R
F
A
P
I
+
∑
𝐶
𝑘
⋅
R
R
F
𝑘
×
100
%A
i,theo
        ​

≈
C
API
        ​

⋅RRF
API
        ​

+∑C
k
        ​

⋅RRF
k
        ​

C
i
        ​

⋅RRF
i
        ​

        ​

×100

其中 API 的 RRF 取 1。

计算回收率与偏差：

R
e
c
o
v
e
r
y
(
%
)
=
%
𝐴
𝑖
,
f
o
u
n
d
%
𝐴
𝑖
,
t
h
e
o
×
100
Recovery(%)=
%A
i,theo
        ​

%A
i,found
        ​

        ​

×100

并计算每一水平的平均值、RSD。

判定建议

回收率：一般 80–120% 可接受；对报告阈值附近可放宽到 70–130%（依据企业 SOP/药典条款）。

精密度（RSD）：每一水平 ≤15%（报告阈值附近可稍放宽），或满足企业内控。

线性/一致性：三水平回收率随水平不应出现系统性漂移（趋势检验）。

B. 重配比法（Gravimetric Blend / Composition Check）

场景：对照品有限或想一次验证“总有关物质”的整体准确度。

思路：以称量配比方式，制备 API + 若干已知杂质 的“人工样品”，让各杂质在目标范围值附近（如：0.05%、0.10%、0.15%……）；用归一化法测得各杂质的 %Area，并与理论配比（按 RRF 修正后的理论归一化百分比）比较。

步骤

按目标配比（质量分数或摩尔分数）精密称量混合（注意含量换算、纯度校正、水分/残溶修正）。

上机测定，得每一杂质的归一化 %Area。

计算“相对误差（RE%）”：

R
E
(
%
)
=
%
𝐴
𝑖
,
f
o
u
n
d
−
%
𝐴
𝑖
,
t
h
e
o
%
𝐴
𝑖
,
t
h
e
o
×
100
RE(%)=
%A
i,theo
        ​

%A
i,found
        ​

−%A
i,theo
        ​

        ​

×100

判定：各点 RE% 在 ±20%（或企业标准）内；均值接近 0，无显著系统偏倚。

补充：

如果某些未知降解产物将来可能出现，可在应力降解样品中检查“质量平衡”：

\text{主成分减少（%）} \approx \text{杂质总峰面积（%）}

在质量平衡 90–110% 的范围常被视作支持“总有关物质”准确性的旁证（不替代已知杂质的准确度验证）。

五、样品与系统的注意事项（归一化法特有）

排除不应计入的峰：溶剂峰、流动相杂峰、系统适用性峰，不计入 ΣA。

基线与积分规则：对小峰、肩峰、拖尾峰要有统一积分规则，并在方法文件中固定；改变阈值/峰宽会直接改变结果。

线性区：确保 API 主峰不饱和、杂质峰在定量限（LOQ）之上且 S/N 合格。

系统适用性（SST）：

分离度（Rs）满足要求（通常 Rs≥1.5 对相邻峰）。

理论塔板数、尾峰因子在控。

进样重复性（API、典型杂质）RSD 合规。

专属性/稳定性：稀释液、流动相空白不应产生干扰峰；样品与标准溶液在“分析时长”内稳定（通常 24–48h 内评估）。

六、记录与判定模板（可直接套用）

对象：Imp-A、Imp-B、Imp-C（如无对照品，用代表性杂质/降解样品）

水平：0.05%、0.10%、0.15%（每水平 n=3）

计算：记录每支的 %A_found、%A_theo、Recovery%、RSD%

判定：

Recovery（均值）在 80–120%（报告阈值可 70–130%）；

RSD ≤ 15%（或企业内控）；

三水平间无系统漂移；

主要已知杂质 RRF 在 0.8–1.2（或采用 RRF 修正/外标）；

质量平衡 90–110%（如做了应力样支持“总有关物质”）。

结论写法（示例）
“本方法在 0.05%–0.15% 范围内对 Imp-A/B/C 的平均回收率分别为 98.5%、101.2%、96.8%，RSD≤5.2%；RRF 在 0.93–1.07；应力样质量平衡为 96–103%。判定准确度符合方法学要求，适用于采用面积归一化法的有关物质定量。”

七、常见疑问（FAQ）

Q1：没有所有杂质的对照品怎么办？

选 1–2 个“代表性结构”的已知杂质做加标回收 + RRF 评估；

做应力降解（酸、碱、氧化、热、光）取得“总有关物质”的质量平衡证据；

如对关键未知杂质存在响应差异风险，改用 RRF 修正或外标法。

Q2：回收率总是<80%或>120%？

先查 RRF 偏差；

检查是否把不应计入的峰算入总面积；

样品溶剂/稀释度是否导致小峰压低（吸附/溶剂效应）；

积分参数是否一致；

必要时对该杂质采用 RRF 修正或剔出归一化，改外标。

Q3：面积归一化能直接用于放行吗？

可，但前提是主要已知杂质 RRF≈1 且准确度/精密度/线性/专属性均合格；否则应采用修正或外标。