细胞活率不稳定

南兮tam

从P4复苏传代，培养至P6，消化收集，离心后，使用溶液A重悬后计数活率为98.10%，再次离心，使用溶媒重悬灌装，灌装完随机取样计数，活率为82.90%，将制剂冻存后，复苏制剂计数活率低于80%，为78.89%。以上为最近常见细胞活率不稳定情况。（1）针对溶液A重悬该步骤已通过研究，可以使用溶液A重悬
（2）细胞在溶媒中的存放时间也通过研究，得到一个时长范围，从细胞加入溶媒到灌装完成，时间都在允许范围内

（3）灌装机通过验证，可正常使用
（4）收获P6时，细胞有拍照，形态和汇合度都合格，80-90%之间。
（5)消化时间按SOP进行，未过度消化，离心参数未改变，人员操作都未改变
（6）重新建库，使用新建库的P4进行培养，P6灌装完，还是会出现活率低80%情况
求助，还有什么地方可以排查？？没招了

逸清草堂

然后你用显微计数，细胞仪计数，流式，最后发现，挖槽，到底哪个是对的

世间始终你好

好——你已经把很多常规项都排过了（溶液A、溶媒存放时间、灌装机、消化/SOP、离心、操作员、重建库复核），那我们把排查范围做系统化、分优先级的“剩余可能性”清单 + 可马上做的小实验/验证，按最快排查→中等难度→深入检测排序，给你一套落地的行动方案，方便现场一步步做并记录证据。
优先级1：快速、容易上手且常常被忽略的项目（立刻做）

• 计数/活率检测方法与操作一致性
  
  
  • 检查计数仪/显微镜/染料（台盼蓝/PI/自动细胞计数仪）是否校准、耗材是否同批、染料配比和染色时长是否一致。
    
  • 实验：同一批样品做两种方法对比（手工台盼蓝 vs 自动计数仪；或台盼蓝 vs AnnexinV/PI），看是否检测方法产生偏差。
    
  • 可能结果：如果方法差异大，问题在于检测而非工艺。
    
    
• 取样位置与代表性
  
  
  • 灌装后“随机取样”是否真实代表整个批次？灌装管路/首尾有无差异？
    
  • 实验：在同一批灌装中，分别从首、尾、中间多点取样检测活率，看有无梯度。
    
  • 若首尾差异大，检查管路残留时间、剪切或沉降问题。
    
    
• 温度记录与短时骤变
  
  
  • 用温度记录器/探针复核从重悬到灌装、从灌装到冷冻每一步的实时温度（特别是灌装过程的管路/料筒）。
    
  • 实验：把温度logger放在代表性位置跑一次完整流程，确认是否有短暂升温/降温或冷却不良。
    
  • 原因示例：短时升温可诱导细胞应激/凋亡。
    
    
• 细胞浓度与氧化/营养瞬时变化
  
  
  • 检查灌装前后细胞浓度是否有显著变化（高密度导致营养耗尽、pH/渗透瞬变）。
    
  • 实验：在灌装范围内做不同装瓶浓度的并行比较，看活率与浓度关系。
    
    

优先级2：中等难度、需要小规模试验或设备监测

• 溶媒/溶液A 的实际物理化学参数（再确认）
  
  
  • 再测一次溶媒与溶液A的 pH、渗透压（osmolarity）、离子强度、配方中有无残余有机溶剂或防腐剂。
    
  • 实验：用生理盐/缓冲液替代做平行对照，或用不同渗透压的缓冲做对比。
    
  • 若渗透压异常或pH偏离，可能造成短时失活。
    
    
• 残留酶/消化液/抑制剂
  
  
  • 虽按SOP消化并离心，但是否有残留胰酶或消化酶影响后续步骤？检查洗涤次数与离心去除效率。
    
  • 实验：增加一次洗涤或加胰酶抑制剂/胎牛血清短暂中和后再重悬，观察活率是否改善。
    
    
• 灌装过程中剪切力 / 流速 / 管路材料
  
  
  • 灌装机可能“验证通过”，但实际运行时管路弯头、阀门、流速会产生局部高剪切。
    
  • 实验：在灌装机上做低流速、高流速、不同管径、不同管材（硅胶 vs PTFE）对比，或用注射器手工灌装做对照。
    
  • 如果手工灌装活率高，说明机械相关剪切/涡流问题。
    
    
• 泡沫与空气接触
  
  
  • 泡沫产生会裂解细胞膜或引起氧化。观察灌装过程中是否有大量起泡/进气。
    
  • 解决：加抗泡剂（经过细胞安全评估）或优化灌装方法避免气泡。
    
    

优先级3：深入检测（需要试剂、设备或外部检测）

• 凋亡/坏死的早期标志检测
  
  
  • 用 Annexin V/PI、Caspase 活性、TUNEL、JC-1（线粒体电位）检测：区分是早期凋亡（可逆/亚致死）还是立即坏死。
    
  • 这有助判断是处理应激（剪切/渗透/pH）还是冻结/复苏问题造成的失活。
    
    
• 冻存/冰冻曲线与CPA（冻存保护剂）分布
  
  
  • 检查混匀方式：CPA（如DMSO）是否快速且均匀加入，是否有局部高浓度暴露导致细胞损伤。
    
  • 检查程序：降温速率、程序箱曲线、冰晶形成控制、预冻保温时间、最终冷冻温度、转移到液氮的时间窗口。
    
  • 实验：做不同添加方式（慢滴入 vs 快混合）、不同降温速率的对照冻存，观察复苏活率差异。
    
    
• 复苏流程细节
  
  
  • 复苏温度、解冻时间、去CPA（稀释或离心）速度、复苏后培养条件（摇床/静置）都影响活率。
    
  • 实验：标准化并记录每次解冻步骤，做对照：直接稀释去CPA vs 离心去CPA，观察哪种更好。
    
    
• 微生物/内毒素/内源性毒性
  
  
  • 虽然形态正常，但低水平污染（尤其mycoplasma、支原体或内毒素）会降低活率或增加细胞应激。
    
  • 检测：mycoplasma PCR、细菌内毒素检测（LAL），常规无菌培养。
    
    
• 代谢/营养指标
  
  
  • 测定培养上清的乳酸、葡萄糖、pH、氨基酸消耗，确认细胞在收获前是否处于代谢不良状态导致脆弱性增加。
    
    
• 细胞遗传/表型变化
  
  
  • 连续传代到P6可能出现细胞应激积累或表型变化（比如Senescence、表面抗原变化）。做β-gal、增殖曲线、表面标志流式看看是否存在亚群变动。
    
    

建议的“快速实验矩阵”（最小可行DOE）做一个2×2×2小矩阵，因素与水平示例（每组做3个重复）：

• 因素A：灌装方式（机器标准 vs 人工慢速灌装）
  
• 因素B：溶媒处理（常规洗涤1次 vs 增加一次洗涤/中和）
  
• 因素C：冷链/温度（有温控记录器确认→理想 vs 模拟短升温）
  测量指标：灌装后即时活率、冻存后复苏活率、AnnexinV早期凋亡比率、显微形态。
  
  

决策树（如果某一测试为真，下一步）

• 如果灌装首/尾差异显著 → 优先检查管路流速、沉降、灌装停顿与首尾排空策略。
  
• 如果手工灌装活率高于机器灌装 → 检查剪切/阀/泵/管径/流速，必要时更换管材或降低流速。
  
• 如果增加洗涤或中和后活率好转 → 说明残留酶或抑制物存在，优化洗涤步骤并加QC检测残留酶/蛋白酶活性。
  
• 如果Annexin V 提示大量早期凋亡 → 指向应激（渗透、剪切、温度）；重点看短时暴露事件与溶媒渗透压。
  
• 如果复苏方式对活率影响最大 → 优化解冻和CPA去除策略，标准化培训并写入SOP。
  
  

记录与证据（非常重要）

• 每次做对比都完整记录：批号、时间点（精确到分钟）、温度/日志、操作人、仪器编号、耗材批号、计数法、稀释倍数。
  
• 建议形成“排查表格”：列出每个假设、实验步骤、预期结果、实际结果、结论。便于以后监管或内部CAPA。
  
  

立即可做的 6 项“立刻执行”清单（一天内）

• 同样样本做两种计数法对比（台盼蓝 vs 自动/流式）。
  
• 灌装首/中/尾多点取样检测。
  
• 在灌装管路放温度记录器做一次完整流程。
  
• 增加一次洗涤并做并行对照（看活率是否回升）。
  
• 手工小批量灌装与机器并行对比。
  
• 做一次Annexin V/PI（复苏后立即检测）判断是否早期凋亡为主。
  
  

姣妹崽

全程都是移液枪操作、取样吗？

考虑设备变更、设备部件变化、取样工器具变化情况，包括但不限于厂家、型号、批号等

南兮tam

姣妹崽 发表于 2025-10-15 10:34
全程都是移液枪操作、取样吗？

考虑设备变更、设备部件变化、取样工器具变化情况，包括但不限于厂家、型 ...

移液枪操作，然后灌装机灌装，你提到的内容，都没有变

window

溶液Ａ重悬后　取部分样品　留样按后续工序的时长分别再测定活率
同样　溶媒重悬后也留样　平行比对

风暴少年

逸清草堂 发表于 2025-10-14 17:04
然后你用显微计数，细胞仪计数，流式，最后发现，挖槽，到底哪个是对的

不知道，但是只要有一个能重复合格就是对的

南兮tam

window 发表于 2025-10-28 18:37
溶液Ａ重悬后　取部分样品　留样按后续工序的时长分别再测定活率
同样　溶媒重悬后也留样　平行比对

好的，感谢~

逸清草堂

风暴少年 发表于 2025-10-29 08:46
不知道，但是只要有一个能重复合格就是对的

那还是显微计数吧，我每次都让他重复重复再重复哈哈哈

Haoim1

如果活率没有错的话，再次离心到灌装完成，这个阶段有啥问题？灌装时间过长？