微生物方法适用性黑曲霉回收率很大

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诸君，请教一下在使用平皿法进行微生物限度检查方法适用性时，多次出现黑曲霉试验组菌落数远远超过菌液组菌落数，造成回收率不合格的情况，这种结果会是什么原因导致的？在加菌时使用同一把移液枪同一枪头从同一管菌悬液中取

世间始终你好

看起来是“黑曲霉孢子在对照组成团、在样品组被分散开了”，导致样品组计数明显高于菌液对照组（回收率>100%）。黑曲霉（A. niger）分生孢子强疏水、易聚集，这在平皿法尤其明显。常见成因及对应改进要点如下——直接照着改流程，基本都能把问题压住：
可能原因（为何样品组＞对照组）

• 孢子团聚/分散不一致
  
  
  • 对照组：孢子成团 → 每团只长1个菌落 → 计数偏低。
    
  • 样品组：样品或稀释液里含有表面活性剂/蛋白/多糖等分散因子 → 团聚被打散 → 实际菌落数更多。
    
    
• 混匀不足 & 静置分层
  孢子易沉降、附壁、黏在管壁/枪头上；若“只在第一下混匀，随后多次取样”，越到后面越不均匀。
  
• 移液操作引入的系统性偏差
  反复用同一枪头跨多皿加菌，会有残留液体携带与滴挂问题；且每次取样前若未重新混匀，波动更大。
  （同一枪头同一管取多次，是高风险做法。）
  
• 平皿法的“热冲击/包埋效应”
  熔融琼脂温度略高或冷却不一致，会使对照组部分孢子受损，而样品组里若有“保护/缓冲”组分，受损更少，反而更“多”。
  
• 对照体系与样品体系不等势（matrix mismatch）
  对照组用的稀释液/中和剂与样品组不同（无/少表活、无机盐浓度不同、pH差异），导致孢子分散性与成活率不同。
  
• 原始接种浓度估算偏低
  黑曲霉制备悬液若未加表活或未充分分散，用浊度/平板回算往往低估（团聚＝少计），样品组“打散后”显得超标。
  
  

立即可落地的改进与最佳实践

• 制备“真·可分散”的黑曲霉悬液
  
  
  • 用0.85–0.9% NaCl或胰蛋白胨水 + 0.05–0.1% Tween 80（必要时加数粒无菌玻璃珠），充分振荡≥60秒；必要时轻柔超声10–30秒。
    
  • 接种前每次取样都先短促涡旋（5–10秒），绝不“摇一次用到底”。
    
  • 目标接种量：每皿50–200 CFU区间最稳（过低波动大，过高重叠大）。
    
    
• 对照要“矩阵等势”
  
  
  • 方法适用性时，菌液对照应与样品组使用同配方的稀释液/中和剂（含相同浓度的表活、中和成分、pH、离子强度）。
    
  • 若样品里自带表活/蛋白，给对照也配“等势稀释液”，避免分散性差异。
    
    
• 规范移液
  
  
  • 每个平皿更换新枪头；先预润湿枪头（吸放同一液体2–3次）；枪头保持垂直、缓慢等速放液，尽量贴壁。
    
  • 逐皿逐次短涡旋后立即取样，减少沉降带来的浓度梯度。
    
  • 同一批平皿按随机顺序加菌，避免“先后顺序偏差”。
    
    
• 优化平皿法细节
  
  
  • 熔融培养基冷却至44–47 °C再倒入，温度超50 °C会显著杀灭孢子。
    
  • 倒入后迅速、温和旋转混匀，避免孢子全部沉到底部或集中在某一象限。
    
  • 若仍不稳定，改用涂布法（spread plate）做适用性（避免热冲击/包埋差异），或改薄膜过滤法（抗抑菌基质更易处理中和与冲洗）。
    
    
• 校准“目标接种量”与回收率判定
  
  
  • 先用“已分散的黑曲霉悬液”做预实验，确认能稳定给出80–120 CFU/皿这一类“工作区间”。
    
  • 每批适用性做并行重复（≥2皿）；回收率计算用平均值，若RSD超阈值（如≤35%对真菌会宽一些），优先排查分散与操作一致性。
    
    
• 样品因素专项排查
  
  
  • 样品含非离子表活（如吐温/聚山梨酯）、蛋白、黏多糖、氨基酸盐等，确实会打散孢子团聚并提高表观回收率；此时做“加标回收对照（等势对照）”即可消除偏差。
    
  • 如果样品有抑菌性，需确认中和/稀释是否充分，否则会出现“另一种极端”（样品组偏低）。
    
    

一套推荐的小SOP（供直接替换现有做法）

• 斜面培养黑曲霉5–7天，生长良好后，用0.1% Tween 80生理盐水洗脱；加2–3粒玻璃珠，剧烈涡旋60–90秒。
  
• 过无菌棉/纱简滤去大块菌丝；必要时轻度超声10–20秒。
  
• 计数/预平板，调整至目标接种浓度（落在50–200 CFU/皿）。
  
• 适用性试验中：为样品组与对照组均使用同一配方的稀释液/中和剂（含同浓度Tween 80等）。
  
• 每加一个皿前短涡旋，更换枪头，立即接种。
  
• 倒平板时维持44–47 °C，倒后环形轻旋10–15秒。
  
• 平行皿≥2；记录每步温度、时间与混匀次数；计算回收率与RSD。
  
  

按上面做，通常能把“样品组远高于对照组”的假阳性差异消掉；若仍超出（>200%），优先检查：是否所有对照都用到了等势稀释液、是否任何一步出现“未混匀就连续取样”的情况、是否有单次倒皿温度偏高。

不见猫骨头

那如果试验组一个枪头，菌液组一个枪头的呢，枪头带不带滤芯，初步是怀疑枪内存留了一些孢子，所以后续的会多一些

为了微生物

试验组菌落数的2个平皿多少CFU？菌液组菌落数2个平皿多少CFU?

八档丶电风扇

孢子悬液没混匀？或者样品本身含菌量较高？

1760595202

不见猫骨头 发表于 2025-08-21 08:31
那如果试验组一个枪头，菌液组一个枪头的呢，枪头带不带滤芯，初步是怀疑枪内存留了一些孢子，所以后续的会多一些

今天试了换枪头，看看有无影响

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1760595202

为了微生物 发表于 2025-08-21 08:45
试验组菌落数的2个平皿多少CFU？菌液组菌落数2个平皿多少CFU?

菌液组67cfu，试验组167cfu，以前有碰到过回收率1.7的，这么大的还是第一次见到

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1760595202

八档丶电风扇 发表于 2025-08-21 09:31
孢子悬液没混匀？或者样品本身含菌量较高？

可能跟样品有点关系，本底虽然没有检出，但是样品主成分聚乙二醇4000，菌液组用pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液替代，可能孢子分散程度不一

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