一些微球剂型的细菌内毒素检查有疑问跪求大佬解惑

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公司生产的明胶微球，原料明胶（控内毒素小于30eu/g）的内毒素检查前两个鲎试剂0.25和0.125存在干扰用的是0.06的鲎试剂，然后制成的明胶微球80%成分含明胶所以也用了0.06的鲎试剂标准和明胶原料一致。25年版药典对于这些包裹类剂型需要释放内容物，我们也做了降解然后检测成品发现干扰性很大又回头做了降解液（胶原酶生物酶类，以及pbs，和hbss缓冲液的内毒检查），phs和hbss这些缓冲液假阴性供阳不凝固，64倍稀释也不凝固，然后含pbs缓冲液的胶原酶降解液在4倍8倍呈现供试品供阳不凝固的干扰性，16至32倍的话供试品和供阳都凝固的阳性，目前来看可能是pbs的干扰性和胶原酶的内毒超标双重影响，这个是否需要改换方式用不含内毒的胶原酶降解在用显色光度法测量成品实际内毒含量，感觉凝胶法不适合也做不出

世间始终你好

你遇到的问题很典型：包裹/载体制剂在“释放内容物后”做 BET（LAL）时，缓冲液（PBS/HBSS）和酶（胶原酶）都可能同时引入两类干扰——抑制（假阴性）和增强/假阳性；加上酶本身可能含有内毒素，导致“稀释后部分凝固/假阳性→再稀释又变为阳性/阴性混杂”的复杂现象。下面给出一套实用、可验证的排查与整改路线（含参考文献/法规要点），按步骤做能把问题定位并建立合规的放行/检测方法。
快速结论（一句话）是的：

• 先按药典/USP 的“抑制/增强”程序系统性定位干扰源（分别检验 PBS、HBSS、胶原酶、降解液），并计算最大有效稀释倍数（MVD）；
  
• 如果胶原酶本身内毒素超标或 PBS 产生强干扰，建议改用无内毒（endotoxin-free）或去内毒处理的胶原酶并用无内毒缓冲（或用去除缓冲/透析）做降解；
  
• 同时考虑用定量型试法（chromogenic/kinetic）或 rFC（重组因子C）法替代/并行验证，因为它们对主观凝胶判定更稳健且更易量化/验证。
  
  

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详细排查与整改步骤（可直接上台做的实验流程）

• 分别检测各单独试剂的内毒与干扰性（最先做）
  
  
  • 对象：胶原酶（原液）、PBS、HBSS、以及降解后仅含缓冲的“空白”降解体系（即不含明胶但含同量胶原酶和缓冲）。
    
  • 目的：判断是哪一项本身含内毒（直接测）或产生抑制/增强（用加标回收试验）。
    
  • 方法：对每个试剂做标准加标（PPC/positive product control）—按药典/USP 做 5-6 步稀释梯度并测加标回收（建议起始稀释 1×、2×、4×、8×、16×、32× 等），记录何处分别出现不凝固/凝固。注意使用无内毒的稀释水和耗材。
    
    
• 做“抑制/增强”（inhibition/enhancement）验证并确定最大有效稀释倍数（MVD）
  
  
  • 依据（药典/USP）原则，一个稀释被认为“无干扰”需使加标回收在**50–200%**范围（多数资料与药典通用做法）。如果某一倍数满足此恢复范围，可用该倍数作为常规检验稀释；若需更高稀释会影响方法灵敏度，就必须采取其他手段（更换试剂或去除内毒）。
    
    
• 若发现胶原酶“本身内毒高”——两条路线（择其一或并行）
  
  
  • 直接采购无内毒/低内毒（endotoxin-free / certified low-endotoxin）胶原酶或者用供应商的 GMP 级/经验证的酶。
    
  • 或对当前胶原酶做去内毒处理（如内毒素吸附树脂、Triton X-114 相转移、或专用 Endotoxin Removal 试剂盒），然后再测回收与活性（去内毒不得破坏酶活性，需同时验证）。文献与试剂厂家有多种可用方法和商品化树脂。
    
    
• 若发现 PBS/HBSS 导致强抑制/假阴性或假阳性
  
  
  • 优先替换为WFI / 无内毒缓冲（或用经内毒去除的 PBS）。
    
  • 或将降解后样品做缓冲交换/透析/超滤（把 PBS 换为无内毒水或中性无内毒缓冲），再测内毒。这样可以把“缓冲矩阵”的影响去掉，而保留释放出的内毒。
    
  • 另外注意：某些离子强度/盐浓度会影响凝胶法判读，缓冲浓度的改变也会改变干扰。
    
    
• 方法学改进：优先用定量/动力学或 rFC 方法
  
  
  • Gel-clot（凝胶法）对主观判读敏感，且更易被基质干扰导致“部分凝固/不稳定”的判断困难。建议采用chromogenic (显色) 或 kinetic（动力学）法或者 rFC（重组因子 C）法作为主检或并行比对，因其可读 OD/曲线、定量更稳定，且在遇到复杂基质时更方便做稀释曲线和抑制/增强验证。USP/EMA/FDA 的文件也支持这些方法，并已将 rFC 纳入可替代方法。
    
    
• 验证/放行策略要点（验证文件里要写清楚）
  
  
  • 记录PPC（正对照加标）回收在验证稀释下满足 50–200%（或你单位更严格的范围）；记录空白、阴性对照、阳性对照。
    
  • 计算并记录MVD（Maximum Valid Dilution）：保证在你选的稀释倍数下，检测限仍能覆盖产品允许的内毒上限（按给药途径、最大单次量、受检体重等计算 endotoxin limit），不要稀释到无意义的灵敏度。)
    
  • 如最终选择用酶降解+缓冲交换步骤，验证该步骤不会引入/去除内毒（即对回收有系统性影响），并在 SOP 中规定使用经验证的无内毒耗材/酶。
    
    
• 若你想继续用凝胶法（不推荐作为唯一法在复杂基质时）
  
  
  • 可以，但必须非常严格地做抑制/增强研究并记录：哪一倍数出现“供试品供阳不凝固”、“供阳与供试品都凝固”等情形；如果没有能兼顾灵敏度的无干扰稀释，就不得用凝胶法放行，应转为定量法或更换降解方案。
    
    

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一个建议的具体实验顺序（实验员可以直接照着做）

• 用无内毒水直接检测：胶原酶原液、PBS、HBSS（各三并行），记录 EU/mL（若酶为蛋白样品可先稀释以便读数在线性区）。
  
• 对上述每项做加标回收（例如加标准内毒素 0.5 EU/mL 或按你要验证的灵敏度加标），做 1、2、4、8、16、32、64 倍稀释，记录恢复率和凝胶/OD 曲线。
  
• 若胶原酶显示 >放行限或加标恢复差且无法通过稀释解决：更换无内毒胶原酶或做去内毒处理→再重复步骤 1–2 并同时测酶活性以确保功能保存。
  
• 若 PBS/HBSS 显示强抑制（例如你的情况 64 倍仍不凝固）：改用 WFI 或无内毒替代缓冲，或在降解后做缓冲交换/超滤再测。
  
• 并行用 chromogenic/kinetic 或 rFC 方法测同一批样品作比对，若两法一致则可作为确认。
  
  

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为什么推荐替换胶凝法或并行 rFC/chromogenic？（要点、并举文献）

• 凝胶法主观判定且对基质干扰敏感，复杂降解液（含蛋白、盐类、酶）常出现“部分凝固/供阳供试不一致”的情况，正是你现在遇到的表现。
  
• rFC（重组因子 C）和 chromogenic/kinetic 方法能提供定量 OD/动力学曲线，方便做稀释校正、线性与回收评估，且 rFC 已被纳入主流药典/监管讨论并被证明在很多矩阵下更等效稳定。
  
  

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可能的阻碍与注意事项

• 去内毒处理可能损伤胶原酶活性：任何去内毒操作都必须同时验证酶学活性（降解效率）和内毒残留。
  
• 稀释会降低方法灵敏度：选定稀释倍数时必须计算是否仍能检测到产品允许的最大内毒（MVD 概念）。
  
• 供应商资料/证书很重要：购买无内毒酶时要拿到供应商的 endotoxin certificate（或批次检测报告）并在供应商变更时重新验证。
  
  

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参考/依据（你可以把这些加入验证/论证段落）

• FDA guidance: Pyrogen and Endotoxins Testing — Q&A;（关于 BET 方法、抑制/增强、方法替代的建议）。
  
• 关于 LAL 抑制/增强与解决办法的综述（行业/期刊综述）。
  
• rFC 与 LAL 的比较与 rFC 作为可行替代的资料。
  
• 关于内毒去除（树脂、相转移、试剂盒）的厂商/指南资料（Thermo/厂商说明）。
  
• 关于 PPC（加标回收）接受区间 50–200% 的说明与常用实践资料。
  
  

17606528433

世间始终你好 发表于 2025-10-27 11:09
你遇到的问题很典型：包裹/载体制剂在“释放内容物后”做 BET（LAL）时，缓冲液（PBS/HBSS）和酶（胶原酶） ...

好的好的，感谢大佬，