[转贴]培养基灌装验证(一)

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2016-04-27 来源：北纳创联

由于绝大多数厂家选用培养基对无菌生产工艺进行验证，并且其中又包括多种方法。本文重点介绍目前较为通用的方法，即采用液体培养基(或营养肉汤)进行灌装模拟试验。
一、培养基灌装试验的频率
新建无菌工艺生产线或生产工艺发生重大更改后，每个班次必须经至少连续3批合格的培养基灌装试验后方可证明被验证工艺的可靠性。
常规生产条件下的再验证频率：每年至少两次，每次每个班次至少灌装一批。
如果因培养基灌装试验不合格而重新灌装，灌装时间(班次)要与初始灌装的时间(班次 )相同，灌装批次(1~3批)依调查结果而定。
二、模拟试验中必须注意的方面
1．尽可能地模拟日常实际生产时的所有关键工艺过程，设备运行方式与常规生产相同：当一条生产线生产多种产品时，可将各种最高风险因子组合在一起，如用最大敞口容器、最低灌装速度、冻干的装卸过程模拟、以及非密封容器的最长允许放置时间等。
2．模拟试验须尽可能地模拟实际生产中的最差状况，包括在一个班次中可能会碰见的所有干扰和维修活动。
3．灌装体积一般说来，每只容器的培养基灌装体积不得少于其总容积的．1／3，这样才能保证有足够数量的培养基与容器的内表面充分接触并且易于观察到微生物的生长状况；培养基也不能灌满容器，以保证容器内有足够氧气，同理，容器内不要冲氮气等惰性气体(即使产品有此要求)。
4．灌装数量确定培养基的灌装数量时要考虑以下两个主要因素。一是培养基的灌装数量应符合统计学要求，即在95％的置信限至少能检出1‰的污染率；二是被验证工艺的日常实际生产批量，因为实际生产批量与无菌工艺操作所持续的时间和灌装速度密切相关，而培养基灌装的持续时间应足以涵盖实际生产条件下的全部操作，并且培养基的灌装数量应能反映出在等于或小于实际生产时的灌装速度下产品及容器所暴露时间的“最差状况”。因此，当某无菌生产线的实际生产批量大于3000瓶时，则培养基的灌装批量不得少于3000瓶；当无菌生产线的实际生产批量最多不超过3000瓶时(包括临床试验产品)，则按日常最大批量灌装培养基即可。
5．培养基的灌装模拟试验应安排在一周的不同日期内进行，灌装时间要涵盖实际生产时间。
6．如果在不同房间内有相同的生产线，则要对每条生产线进行灌装。
7．此外，为便于查找污染源，最好能将整个无菌工艺过程拍摄下来，并将盛装容器的托盘做好次序标记等。
三、培养基的选择
培养基灌装的目的是为了尽可能地检出无菌生产工艺系统中可能会给实际产品造成污染的微生物，因此，用于无菌工艺验证的培养基应符合以下质量要求：
1．尽可能适应广谱微生物的生长，包括细菌、真菌和酵母菌等。验证试验前，可用下述方法来鉴别验证用培养基的可行性。严格按照培养基生产商的要求进行配制和灭菌。将无菌培养基分装至一定数量的无菌小瓶或试管内。同时，制备好3种微生物[枯草芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌]的悬浮液，菌液浓度控制为100~1000／ml。将上述准备好的无菌培养基分成3等份，且每份至少两瓶(或支)，分别向其中加入上述菌悬液各0．1ml。将接有枯草芽胞杆菌和金黄色葡萄球菌的培养基于30~35℃下培养，接有白色念珠菌的培养基于20～25℃下培养。如果在7天内，每种微生物培养基均至少有50％出现长菌，则认为该培养基可用于无菌工艺验证试验。并且，在灌装和培养结束时，还要进行灵敏度检查。
2．培养基浓度须符合培养基供应商的使用说明要求。
3．具有较好的澄明度培养基的澄明度较高，有助于检查出受污染的浑浊培养基。
4．可除菌过滤如果无菌工艺需使用除菌过滤器，则无菌工艺验证用培养基也应在生产线上模拟除菌过滤程序。
四、无菌培养基的制备
对于产品溶液与培养基溶液配制方法相似的无菌生产线来说，可用培养基替代产品组分完全模拟实际生产时的配液操作情况进行培养基配制(按培养基生产商的要求配制)，除菌过滤、并将除菌后的培养基溶液接入一无菌接收罐。
对于那些产品溶液配制方法与培养基溶液配制方法不同或是生产粉针剂的无菌生产线来说，可按照下述方法制备无菌培养基。在洁净区内，将事先称量好的培养基加入一无菌的洁净配制罐内，按照培养基生产商的要求加入适量的注射用水进行配制，充分搅拌直至培养基完全溶解，调节培养基溶液的pH值至规定范围( pH 7.2 ± O.2 )。在一无菌环境条件下，用一无菌管路将配制罐与已灭过菌的装有0.22μm滤膜(或滤芯)的过滤器的进口端连接起来；无菌操作，用一无菌软管将除菌过滤器的出口端与一无菌的储罐(储罐顶部的通气口应配有 0.22μm 的疏水性过滤器)连接起来；通过加压或减压将培养基溶液经除菌过滤后转移至无菌储罐内。过滤结束后，检查除菌过滤器的完好性，如果过滤器的完好性检查结果合格，则无菌培养基制备完成。

来源：http://www.bncc.org.cn/news/n1490.html

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2016-04-27 来源：北纳创联

五、无菌灌封
由受过培训的无菌生产操作人员模拟实际灌装作业进行培养基灌装。灌装容器及胶塞应尽可能与常规产品生产时的一致(但对粉针生产线来说，可能要额外装配适当的液体灌装头)。容器、胶塞和灌装设备的关键部件以及装瓶用托盘容器均应按照既定的标准操作规程进行清洗和灭菌。灌装时，最好能模拟实际生产时的最差状况，如设备维修、操作人员的更换等，以掌握在实际生产条件下产品污染的真实资料。根据不同剂型，分别按下述方法进行灌装模拟试验。
(一)液体制剂需要进行培养基灌装模拟试验的液体制剂主要包括：玻璃瓶或塑料瓶装针剂、塑料瓶装滴眼剂和滴耳剂以及安瓿产品等。
灌装前，应按药品生产时所允许的最大时间保存无菌培养基；如果药液有冷藏要求，则要对培养基模拟该程序。灌装时，在各自的液体产品生产线上按生产时的最低速度灌装无菌培养基，灌装后直接压塞或熔封。值得注意的是，有些塑料容器因透明度不高而影响结果观察，须采取额外措施进行检查；如果是非透明容器，则要将内容物例出来检查。
(二)粉针剂有两种方法适用于粉针剂的无菌灌装模拟试验。一种方法是在灌装线上直接灌装无菌液体培养基；第二种方法，在向容器内加入稀释剂(注射用水或液体培养基)之前或之后，在无菌灌装线上往容器内灌入培养基粉末或惰性粉末。常用的惰性材料有聚乙二醇8000和羧甲基纤维素等。
(三)悬浮剂此类产品的生产工艺与液体制剂相似，不同之处在于它需要不断搅拌或循环流动以保持组分处于悬浮状态。因此，在进行培养基灌装模拟试验时，需要模拟此过程。如果在灌装前需要无菌操作添加物料，那么，在进行模拟试验时，也得用培养基或惰性材料模拟此过程。
(四)冻干剂灌装过程与液体制剂类似。但是，在灌装后只进行半压塞，模拟实际操作将半压塞瓶转移至冻干机内。培养基的冷冻温度不得低于3℃，因为温度过低会使一些微生物死亡或受到损伤，造成污染水平降低的假象，不能如实反映无菌工艺的实际无菌保证水平。模拟冻干时，适当进行部分真空而不需充氮保护(请注意，真空度不宜过高，否则会引起培养基暴沸；充氮会抑制需氧性微生物的生长)。冻干结束后，在腔室内全压塞，然后卸出并转移至压盖间压盖。将压盖后的培养基上下颠倒几次以使培养基与胶塞及整个容器内壁充分接触。从灌封至最终的培养检查，应将盛装培养基瓶的托盘容器做好标记，以便于对所出现的偏差进行追溯。
(五)半固体制剂(如无菌软膏) 模拟试验时，宜按照常规生产工艺将液体培养基增稠到适当粘度。可用琼脂和羧甲基纤维素作为增稠剂，也可选用其他试剂，但要证明其没有抑细菌或抑真菌作用。装软膏用的塑料或金属管无法检查培养基是否被污染，因此，在培养结束后，需将培养基挤出来并置于适当容器(培养皿)内检查其混浊度和真菌菌落，或进行无菌检查。也可采用培养基遇到污染物会变色的方法来替代上述检查，但替代方法需经过验证。
(六)无菌散装药品建议对无菌散装药品的生产工艺进行培养基灌装模拟试验。但是，散装药品的生产工序比成品制剂复杂，通常包括多个步骤，因此，要考虑每个步骤对微生物污染的风险，而且，有些步骤无法使用培养基。

六、培养条件和计数检查
(一)培养和检查一般将培养基倒置(便于和整个容器的内表面接触)于20~25℃下培养14天，每隔7天检查1次。也可先于加。25℃培养7天，再于30～35℃下培养7天。培养期间，也可定期检查培养基，记下每次检出的污染瓶数及出现污染菌的相应托盘编号。检查时将每瓶培养基在有光源的黑色和白色背景下仔细目测。透明、澄清、无混浊的培养基判为无微生物生长；如培养基混浊或有悬浮的菌丝或菌落，则需作进一步的微生物生长检查，以确定培养基是否真正染菌。
(二)记数对已确定有微生物生长的培养基瓶进行仔细检查，看其中是否有破损，有破损的培养基瓶不得纳入最终的结果评价。每批灌装培养基的污染率可按下式计算：

七、污染菌的鉴别
将污染瓶中的污染菌在适当的培养基(如大豆胰蛋白胨琼脂、营养琼脂等)上划线和分离培养。挑取单个菌落进行形态学观察、革兰染色等初步鉴别。如果需要对培养基灌装结果作进一步调查，那么将污染菌鉴别到种，这对偏差调查起到非常关键的作用。寻找污染菌与其他资料(如环境监控资料和录像资料等)间的相关性是无菌工艺偏差调查的有效手段。

八、培养基灵敏度检查
从每批培养后检查好的培养基中随机抽取适量，按照药典现行版附录Ⅺ无菌检查法(或美国药典<71>无菌检查法)中的培养基灵敏度检查法检查培养基的灵敏度，可分别向培养基中接人下列试验菌悬液，每个菌株至少接种两瓶灌装培养基，每瓶接种量为10~100个菌，除表13一1中所列标准菌株外．还应增加灌装时的环境分离菌检查培养基的灵敏度，将接有微生物的培养基置于相应温度下培养(环境分离细菌于30．35℃培养，真菌于30～35℃培养)，每种菌株在七天内应至少有50％出现明显生长，否则，可复试1次。如果灵敏度检查结果不合格，该批培养基灌装试验无效，须重新验证。

来源：http://www.bncc.org.cn/news/n1491.html

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2016-04-27 来源：北纳创联九、环境控制
无菌生产区的环境确认和验证是无菌生产工艺验证的前提条件。无论是静态还是动态，均须对无菌生产区环境进行全面监控。进行培养基灌装时的环境监控资料对整个工艺验证的评价和偏差分析起到非常关键性作用。因此，培养基灌装时的环境监测资料也是评价无菌工艺验证的重要依据之一。
十、结果评价
培养基灌装结果的评价是无菌生产工艺验证中的一个焦点。由于对合格标准的理解存在差异，同一个数据往往会有不同的理解结果。美国药品和食品管理局(FDA)对无菌药品的污染概率作如下规定：
最终灭菌药品的无菌保证水平(SAL)不得低于10-6，即污染概率不得超过1/百万；
无菌灌装药品的无菌保证水平(SAL)不得低于10-3，即污染概率不得超过1‰。
实践证明，对设计合理并且生产操作环境能得到良好控制的无菌生产线而言，其产品污染率维持在1‰以内并不难。企业须通过培养基灌装试验来证明其无菌生产线所生产的无菌产品的污染概率始终维持在这一水平以下。通过试验应能证明，在95%的置信限，产品的污染概率不超过1‰。值得注意的是，尽管您的验证结果表明您的无菌保证水平达到10-3，但并不表示药政部门允许您的上市产品每一千瓶中可以有一瓶是污染品。相反，这只不过是通过验证数据计算出的可接受污染概率的理论值。
有些企业草率地将每批培养基灌装试验时的实际污染率定为他们的合格标准，例如，有人认为一批灌装了3000瓶培养基中有3瓶污染品(污染率为0.1％)是合格的，其实这是不对的。因为它不符合验证试验的统计学要求。在此，我们有必要先弄清计算产品污染率的统计学概念。
如果某批培养基(数量为 N )试验中有 R 个污染品，那么培养基的污染率 p = R/N。在一足够大的样本中，估计比率 -P 以实际比率 p 为中心呈正态分布。其标准偏差：SD = ，其中 q = 1 一 p 。那么，产品的污染率有95％的可能性落在 p ± 1．96SD 范围内。以上述培养基灌装数据为例，以95％的置信限推断，实际产品的污染率范围：

即，产品的实际污染率有95％的可能性在 0 至 0.2％ 之间。
但是，从质量保证角度考虑，我们必须严格控制污染率的上限而不必分析其下限。由此可见，批培养基污染率为1‰时，并不能保证产品的无菌保证水平(SAL)不低于10-3。
表13—2给出了当可信限为95％、时，一次培养基灌装试验中，灌装数量、污染数量与污染概率之间的关系，企业可参照它制定自己的警戒限度和纠偏限度。

十一、偏差调查及纠偏措施
验证试验结果超过限度是无菌工艺验证中的最大难题。这需要进行大量的偏差调查并采取有效的纠偏措施。根据实际经验，在此列出了一套出现偏差后的调查和纠偏方案。
(一)偏差调查
1．检查所有与培养基灌装用物品相关灭菌设备的验证资料和灭菌记录。
2．检查培养基灌装时的环境监控资料，包括空气悬浮粒子、空气浮游菌、空气沉降菌、表面微生物以及操作人员的卫生监测资料。
3．将培养基中污染菌和环境监测时所监测到的微生物逐一鉴定到种，并比较各个污染菌彼此间的相关性。
4．检查相关产品无菌试验结果呈阳性的历史资料，看其污染菌与培养基验证试验中的污染菌是否一致。
5．检查以往的培养基灌装资料，看其中的污染菌是否重复出现。
6．检查培养基灌封用容器及胶塞的完好性。
7．检查培养基灌装时无菌洁区的压差记录，是否符合常规。
8．检查培养基灌装时的维修和清洁记录。
9．检查培养基灌装时的批生产记录和设备运行记录。
(二)纠偏措施务必要仔细回顾和分析所有的培养基灌装资料及其相关资料，以准确找出本次偏差的真正原因。尽管环境监测时能监测到微生物，但多数情况下，也很难发现其与实际偏差有直接的相关性。一旦出现偏差并完成其调查后，须立即实施纠偏计划。以下列出了一些在实施纠偏计划时的基本操作程序。
1．增加培养基的灌装数量和环境监测数据以查明污染源。
2．加强无菌生产环境的清洁和消毒措施。
3．增加灌装前静态下的环境监控数据以检查无菌环境条件的可靠性。
4．用培养基中的污染菌对消毒剂进行挑战性试验，以检查污染菌是否对消毒剂有耐受性。
5．分别于灌装前、灌装时及灌装后，增加对操作人员的卫生监控(手套表面微生物和操作服表面微生物)。
6．增加培养基的灌装批次，以检查所出现的偏差是否具有偶然性。

来源：http://www.bncc.org.cn/news/n1492.html

volador

2016-04-28 来源：北纳创联

一、环境设施的消毒
无菌生产区内的清洁，消毒剂都应当是无菌的，清毒剂喷洒瓶在每次灌装消毒剂前，应事先经过灭菌处理；定期更换消毒剂；当检测到芽胞类微生物时，立即用杀芽胞剂对环境设施表面进行喷洒消毒；所用消毒剂的杀菌效果应经过评价。
二、设备的清洗和灭菌
在无菌生产工艺中有些设备需要人工清洗，如除菌过滤器、灌装头、软管、有时还包括贮罐。在对清洗好的设备进行装配时，要留意将0型圈和垫圈等装配适当，以免发生污染或药液泄漏。
设备在灭菌釜腔室内灭菌时，其包装和放置方式应利于冷空气排出，特别要注意贮罐和过滤器内的各个部位都被充分灭菌。因此，宜采用真空脉动程序对设备和过滤器灭菌，并且灭菌程序须经过验证。
三、过滤器的验证和完好性检查
通常由过滤器生产商进行过滤器的验证试验，但是，药品生产企业需保存其验证资料：如果药品溶液与验证用试剂的差别较大，药厂须向过滤器生产商提供药品溶液，以验证该药液与过滤器同的适应性。
分别在灭菌前和过滤结束后检查过滤器的完好性，只有两次完好性检查均合格，药品方可进行灌装。
四、容器及其密封件的灭菌
无菌针剂产品的玻璃容器在使用前须进行清洗和去热原处理，去热原工艺须经过验证(塑料包装容器是在高温下即时生产出来的，一般不需考虑去热原问题)；胶塞和铝盖的灭菌工艺须经过验证。胶塞间或铝盖间存在的许多间隙导致冷空气很难被彻底排除，因此，胶塞或铝盖的灭菌包装不宜太大，而且包装间的排列不可紧密。须按照工艺验证时的状态要求，对容器及其密封件进行去热原和灭菌处理。
五、包装容器的密封完好性检查
应对无菌工艺产品的包装容器及密封件的完好性进行检查。检查时，一般将在生产线上灌装有培养基的产品容器口(密封处)浸于高浓度的菌悬液(挑战菌株应具有运动性、菌液浓度不低于106CFU/ml )中维持一段时间(通常为4小时)，然后将容器口洗擦干后，置于适当温度(常为30～35％)下培养14天，检查容器内培养基是否被污染，如果没有污染品，则完整性检查合格。例如，同药品的稳定性考察，完整性检查应涵盖产品的整个有效期。
六、气体过滤器的完好性检查
有些药品的生产工艺需使用氮气和(或)压缩空气，生产结束后，务必检查这些气体过滤器的完好性，如果过滤器的完好性检查不合格，则要对相关产品采取相应的处置。
七、成品的无菌检查
无菌检查结果可反映无菌生产工艺的可靠性。特别要注意比较无菌工艺产品的无菌检查阳性率与最终灭菌产品的无菌检查阳性率间的差异，如果前者多于后者，则表明无菌生产工艺存在偏差，建议进行培养基灌装试验以考察无菌工艺的可靠性。

来源：http://www.bncc.org.cn/news/n1499.html

罗伊鲱

实际是在潘友文2002年发表的文献《无菌生产工艺验证——培养基灌装试验》基础上修改的

补充内容 (2017-9-21 13:23):
摘自潘友文的《现代医药工业微生物实验室质量管理与验证技术》2004

补充内容 (2017-9-21 13:23):
摘自潘友文的《现代医药工业微生物实验室质量管理与验证技术》2004

﹏兜兜有糖ミ

学习一下

syhorchid

谢谢分享

大海

学习学习了，谢谢

Anneyu_zY5yM

谢谢楼主分享。。。。。。。。。。

小金库

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