【耀文解读】 默沙东教你如何使用UHPLC-CAD检测LNP组分

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[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]导读：脂质纳米颗粒（LNP）是目前最为先进的mRNA递送系统，LNP能够提高mRNA疫苗的稳定性和细胞递送能力。最早上市的两款mRNA疫苗中的LNP组分分别为：mRNA1273（SM-102、PEG2000-DMG、DSPC和Cholesterol），BNT162b2（ALC-0315、ALC-0159、DSPC和Cholesterol）。对单个脂质组分进行鉴别和定量检测不仅支持工艺和配方开发，也是疫苗生产的关键质量属性。

2021年12月，美国默克公司（默沙东）疫苗分析方法开发团队在Electrophoresis杂志发表文章：《Determination of lipid content and stability in lipid nanoparticles using ultra high-performance liquid chromatography in combination with a Corona Charged Aerosol Detector》。这篇文章是菌菌在PubMed检索到的使用HPLC-CAD检测LNP脂质组分的较早报道。研究者使用UHPLC-CAD 实现了LNP中四种脂质组分的定量检测，同时还可用于分析各个脂质降解产物。一、脂质检测方法简述

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]据报道，早期用于脂质检测的方法包括：气相色谱结合火焰离子化检测器（GC/FID）、液相色谱结合质谱（LC-MS）、高效液相色谱（HPLC）或超高效液相色谱（UHPLC）结合蒸发光散射检测器（ELSD）。然而，GC-FID更适用于挥发性脂质的检测，而对于磷脂、鞘脂等非挥发性脂质，需要进行衍生化处理使其具有挥发性才能检测，存在一定的实验难度和挑战，并且GC-FID不适用于分析高分子量的脂质组分。LC-MS价格昂贵且难以实现高通量样品检测，因此更适合用于研究目的，而不是日常测试。而ELSD的灵敏度较低，无法满足检测需求。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]电雾式检测器（CAD），也称带电气溶胶检测器，是过去十年中发展起来的一种新型通用探测器。CAD特性包括与梯度洗脱的兼容性，不依赖于物质的结构特性和电离效率的响应值，以及具备非挥发性和半挥发性物质的检测能力。当HPLC或UHPLC结合CAD检测器时，脂质样品无需进行衍生化处理，其高灵敏度能够实现大范围脂质组分的分析。

自2021年起，默沙东疫苗团队、中检院、韩国东国大学先后发表使用HPLC-CAD检测LNP脂质组分的研究成果。2023年，美国药典USP更新的“Analytical Procedures for mRNA Vaccine Quality”草案中建议使用CAD检测器鉴别脂质组分、定量检测各组分含量。二、基于UHPLC-CAD检测LNP脂质组分

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]作为最早公布的开发成果，默沙东这篇文章对于HPLC-CAD检测LNP脂质组分、及分析方法开发具有一定的指导意义。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]2.1 样品的稀释处理

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]默沙东团队使用了两种LNP包封的mRNA疫苗作为测试样品，二者分别由两种不同的阳离子脂质（Cationic Lipid 1、Cationic Lipid 2）、PEG脂质（PEG-DMG、PEG Lipid 2）和其他脂质DSCP和CHOLE组成。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]LNP脂质组分的检测中，稀释剂的选择至关重要。稀释剂需满足以下条件：溶解每种脂质成分，并解离脂质与被包封mRNA之间的任何相互作用。研究人员以溶解性、mRNA与LNP相互作用的破坏性、以及回收率为指标，选择乙醇和甲酰胺以85:15比例混合的稀释剂，并根据mRNA浓度确定了稀释倍数。同时为匹配流动相，当检测含有Cationic Lipid 1的样品时，将0.5%甲酸:三乙胺络合物(5: 2)添加到稀释剂中；而含有Cationic Lipid 2的样品，需在稀释剂中添加19.2 mM冰醋酸和16.2 mM三乙胺。

2.2 UHPLC-CAD检测LNP脂质组分

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]研究者首先摸索了色谱条件，最终确定的色谱条件为包含两次等度保持的阶梯式梯度。实验选用Waters UHPLC系统，配备CAD检测器。色谱条件为：C18色谱柱，柱温50℃，流速0.3mL/min， CAD蒸发器温度35℃。文中测定了两种不同的可电离阳离子脂质，流动相组成也不同。①Cationic Lipid 1流动相A由水: 甲醇（1: 1, %V/V）和0.5%甲酸:三乙胺络合物(5: 2)组成，pH值为3.5；流动相B由0.5%甲酸:三乙胺络合物(5: 2)组成。②Cationic Lipid 2流动相A由水: 甲醇（1: 1, %V/V）和19.2 mM冰醋酸、16.2 mM三乙胺组成；流动相B由甲醇与19.2 mM冰醋酸和16.2 mM三乙胺组成。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]色谱条件为阶梯式梯度，如下所示：

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]该分离条件下，两种LNP处方中的脂质组分实现基线分离，研究人员可以准确鉴别、定量检测各个脂质组分。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]图1: UHPLC-CAD鉴别LNP脂质组分

2.3 UHPLC-CAD检测LNP脂质降解产物

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]氧化处理后的脂质体作用检测样品，在优化后的UHPLC-CAD条件下，LNP中4种脂质组分的降解产物可以有效分离。其中PEG脂质的降解产物为肉豆蔻酸、DSPC的降解产物为Lyso-PC1，Lyso-PC2和硬脂酸，而胆固醇不易降解。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]图2: 各脂质降解产物分离效果

综上所述，默沙东团队使用了两种LNP包封的mRNA疫苗作为测试样品，建立了一种高效、灵敏的UHPLC-CAD方法，用于分析mRNA递送系统LNP中的脂质成分。该分析方法的应用场景包括工艺开发和制剂开发研究、以及临床样品放行和稳定性测试。研究还对样品制备和色谱条件进行了优化，以充分回收和分离主要脂质及其潜在降解物。研究者使用两种LNP制剂对分析方法进行了验证，包括线性、精密度、准确度和特异性。三、耀海生物mRNA分析方法开发及检测服务

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]为满足mRNA-LNP的方法开发和检测需求，耀海生物建立了适用的UHPLC-CAD分析方法，4种LNP组分实现基线分离，成功实现脂质组分的鉴别。各脂质组分定量检测线性结果显示，R2均大于0.99。该方法具有很好的重复性。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]图3: LNP脂质组分鉴别与检测：耀海平台HPLC-CAD

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]耀海生物质量研究服务平台，目前已具备针对30多种mRNA原液或LNP制剂成品质量属性的方法开发和检测能力。检测项目覆盖质粒纯度、超螺旋比例、浓度、杂质；mRNA原液完整性、加帽率、poly A尾分布、以及模板DNA、双链RNA（dsRNA）、T7 RNA聚合酶、加帽酶、2-O-甲基转移酶、DNAase I、内毒素、抗生素等工艺或产品相关杂质；LNP-mRNA成品包封率、粒径、Zeta电位、LNP组分与含量，可为 mRNA 疫苗与药物研发提供更准确、更快速、更灵敏的分析检测，全面满足客户项目研发需求。详情可咨询菌菌：13380332910（微信同号）

参考文献

[1] Kinsey C, Lu T, Deiss A, Vuolo K, Klein L, Rustandi RR, Loughney JW. Determination of lipid content and stability in lipid nanoparticles using ultra high-performance liquid chromatography in combination with a Corona Charged Aerosol Detector. Electrophoresis. 2022 May;43(9-10):1091-1100. doi: 10.1002/elps.202100244.

永恩

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xqliu

学习了，谢谢提供分享。

andyzheng

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