抑菌效力检查菌液浓度问题

张娇娇han

产品中有防腐剂，需要进行抑菌效力检查，目前抑菌效力检查所受关注度越来越高，关于原始菌液浓度1ml需要制备成10的八次方，金葡和铜绿都可以做的，白念和黑曲比较困难，但是能制备成10的七次方，因为抑菌效力考察的是1ml中10的五次方和10的六次方，制备成10的七次方也是接受的吧，请教下各位白念和黑曲怎样制备的呢？

世间始终你好

你理解的大方向是对的——抑菌效力（Preservative Efficacy / AET）常用的目标是将挑战菌接种到试样中约10^5–10^6 CFU/mL（不同药典/方法在接种量、类别上有细微差别），因此实验室常把原始菌液（stock）配成约10^8 CFU/mL，用小体积接种后实现试样内的10^5–10^6。药典 / SOP 和 USP 的做法也明确指出要尽量制备 ~1×10^8 的原始菌液；但如果你的操作或菌种特性导致只能到10^7，数学上确实可以在某些接种方案下产生10^5（但 10^6 就不一定能同时得到），所以要注意接种体积与样品体积的关系。
下面给出**Candida albicans（白念）和 Aspergillus niger（黑曲）**常用、实操性强的制备/富集与浓缩方法、注意事项和排错建议（可直接拿去做SOP或在实验室试验验证）：

---

一、基础原则（先看这一段再做）

• USP/常用SOP要点：收获菌体用无菌肽盐液（peptone saline）；对霉菌收获液中通常需加入表面活性剂（如 polysorbate 80 / Tween-80 约0.05%）以帮助释放孢子并防止团聚；目标为原始菌液≈1×10^8 CFU/mL（可接受 1×10^7 但须注意后续接种计算）。接种体积通常不超过样品总体积的1%（或按你们SOP/药典）。
  
• 一定要以平板计数（CFU）来确认实际浓度，而不是只用显微计数或 OD 推断（这些方法用于快速估算，但与活菌CFU可能差别较大，尤其是霉菌孢子或有团聚时）。
  
  

---

二、Candida albicans（白念）——可达到 10^8 的常用流程材料：Sabouraud Dextrose Agar（或 SDA 平板）、Sabouraud/YPD 液体培养基、无菌肽盐溶液（peptone saline，或0.85% NaCl + 0.1%肽）、离心机、微量分光光度计（可选）、无菌玻璃珠/搅拌。
步骤（推荐 SOP 样式）：

• 接种：从保存斜面接种至液体培养基（例如 SDB 或 YPD），37℃或30℃振荡培养（200 rpm）**过夜（12–18 h）**至晚对数/早稳定期，使细胞密度高。
  
• 浓缩：取多管培养物合并（例如每管20–50 mL），4000 rpm、5–10 min 离心（具体 g 值按你实验室离心机），弃上清，将沉淀重悬于小体积无菌肽盐液（例如将合并 200 mL 重悬于 2–5 mL），以提高浓度。必要时重复离心-重悬直到接近目标浓度。
  
• 分散团聚：用无菌玻璃珠轻轻振荡或短暂超声（谨慎、低能量）帮助分散团块，避免破坏细胞。
  
• 估算并校正浓度：先用 OD600 粗估（并用已建立的 OD↔CFU 校正曲线），然后做系列稀释平板计数（例如 10^-5–10^-8 稀释，平板涂布）确认实际 CFU/mL。根据平板结果做最终稀释或浓缩达到 ~10^8 CFU/mL。
  
• 使用前确认：现配现用，配好后立即做平板确认并记录（若需要冷藏要验证稳定性）。
  
  

常见问题/解决：

• 若液体培养不够密（低于 10^8），可合并更多培养物并再离心浓缩；也可使用静置培养在斜面或平板上大量生长后刮取菌体收获（在表面刮取通常能得到更高密度）。
  
• OD↔CFU 在不同菌株/培养条件下差异大，要建立本实验室曲线。
  
  

---

三、Aspergillus niger（黑曲）——孢子（conidia）制备要点霉菌以孢子为主，且易团聚或带有菌丝碎片，需特殊处理。
材料：PDA / Czapek / SDA 平板（利于产孢）、无菌肽盐液 + 0.05% Tween-80（或 polysorbate 80）、无菌纱布/滤网、玻璃珠、振荡器、离心机（可选）。
步骤（推荐 SOP 样式）：

• 诱导产孢：在 PDA 平板或浅平皿上接种 Aspergillus niger，**25–28℃**孵育 5–7 天（或直到明显黑色孢层成熟并大量脱落）以获得大量孢子。
  
• 收获孢子：向平板表面加入无菌肽盐液（含 0.05% Tween-80），用无菌刮棒/玻璃棒和轻轻振荡把孢子从菌落表面洗下，收放入无菌锥形瓶中。若多皿可合并收集。
  
• 去除菌丝：将收获液用无菌纱布或 40–70 μm 过滤器过滤，去除菌丝片段（这一步对获得可重复的 CFU 很重要）。
  
• 分散：在含玻璃珠的管中剧烈震荡（vortex with beads）2–3 min，确保孢子分散、减少团聚。
  
• 浓缩（如需）：与酵母类似，可离心（较低转速以避免孢子受损）把大量孢子沉淀，重悬于少量肽盐液。
  
• 计数与校正：用血球计数板（hemocytometer）估算孢子数目作为快速方法，再进行平板稀释计数以获得实际 CFU/mL（注意：肉眼计数/血球计数是颗粒数，不等于 CFU，务必以平板结果为准）。根据平板结果调整稀释/浓缩，目标 ~1×10^8 CFU/mL（若只能到 1×10^7，后面要注意接种稀释倍数）。
  
  

常见问题/解决：

• 团聚/菌丝污染：用 Tween-80 + 过滤 + 玻璃珠振荡可以显著减少团聚和菌丝残留。
  
• 孢子活性问题：老化孢子或储存过久会丧失活性，建议当天收获当日使用或验证保存条件。
  
• CFU 与显微计数差异：血球计数一般高于 CFU；一定用平板计数校正。
  
  

---

四、如果只能配到 10^7，如何处理（实务建议）

• 确认接种计算：常见接种法例如向 10 mL 样品中加入 0.1 mL stock（即接种体积为样品体积的1%），则 delivered CFU/mL = stock × (0.1/10) = stock × 0.01。
  
  
  • stock = 1×10^8 → delivered = 1×10^6（OK）
    
  • stock = 1×10^7 → delivered = 1×10^5（仍可，但只能达到 10^5）
    因此若你们的方法要求同时试验 10^5 和 10^6 两个挑战量，就要确保 stock 能达到 10^8 或调整接种体积/样品体积（但必须满足药典/SOP 关于接种比例的规定）。
    
    
• 用离心浓缩法：合并大量培养物，离心沉淀后把沉淀重悬于更小容积（见 Candida 步骤）。这通常能把 10^7 → 10^8。对霉菌，先用 Tween-80 分散，再离心浓缩。
  
• 增加接种小体积限制的核查：如果你们方法允许接种体积稍大（仍在方法/药典允许范围内），理论上也可用 10^7 stock 用更大体积接种以达到 10^6，但不要越过药典/方法规定的接种体积上限（许多方法限制接种体积不超过样品体积的1%）。务必先确认你们遵循的标准（USP/中国药典/公司SOP）对接种体积的要求。
  
  

---

五、质量与记录（SOP 必备）

• 每一批 stock 都做**平板计数（至少两个平行）**并记录 CFU/mL（作为原始菌液证据）。
  
• 记录培养条件（培养基、温度、时间、振荡速率）、收获方法（是否使用 Tween-80、过滤、超声）和任何浓缩步骤。
  
• 对每次制备做趋势记录，若某株始终低于目标，记录并分析原因（株系差异、培养时间、产孢不足等），并在验证阶段说明可接受的最小浓度及调整方法。
  
  

---

六、快速排错（常见原因与对应修正）

• 达不到 10^8：合并更多培养体积并离心浓缩；改用表面刮取斜面/平板后重悬；延长培养时间到晚对数/早稳定期（但避免死亡期）。
  
• 霉菌有大量菌丝或团聚：加入 0.05% Tween-80 + 过滤 + 玻璃珠振荡。
  
• 平板计数远低于显微计数：说明有团聚或死菌、或孢子不产芽，依赖平板计数为准。
  
• OD 校正偏差：建立本实验室的 OD600 ↔ CFU 曲线（不同培养条件/株系差异大）。
  
  

---

七、参考（可据此写入你的SOP/引用）

• USP Chapter <51> Antimicrobial Effectiveness Test（AET）原则与接种/收获建议。
  
• 各类 SOP / 实验室指南关于用 peptone saline 收获 Candida、并用 peptone saline + 0.05% polysorbate-80 收获 Aspergillus 的描述。
  
  

---

不见猫骨头

白念离心，去上清，直接浓缩就行了；黑曲，刮下来可以达到浓度

老道look

学习！！！！！！！！！！！！！！！！！

张娇娇han

不见猫骨头 发表于 2025-8-15 13:19
白念离心，去上清，直接浓缩就行了；黑曲，刮下来可以达到浓度

通过什么方式确定浓度呢？我们使用比浊仪进行测定，但白念和黑曲因为孢子较大，只能测出10的7次方，如果通过将原始培养物进行同比例稀释再测定浓度的话，稍有不慎，稀释错了，原始培养物浓度就没办法制备成10的八次方。

张娇娇han

世间始终你好 发表于 2025-8-15 12:01
你理解的大方向是对的——抑菌效力（Preservative Efficacy / AET）常用的目标是将挑战菌接种到试样中约10^ ...

感谢提供很多指导思路。这个问题，也是想和各位学习下，如果制备10的八次方比较困难，能不能接受10的七次方。另外也比较好奇药典规定的这个10的八次方，如果我的样品是10ml，按照接种要求，接种10ul的10的八次方原始菌液就够了，但是如果我加入100ul的10的七次方原始菌液，也能达到我的要求。目前关于10的八次方是不是强制，认真读药典，原始菌液制备写的是约10的八次方，如果有人较真，这个问题就是无解的。

婵34f54f29

张娇娇han 发表于 2025-8-15 15:17
通过什么方式确定浓度呢？我们使用比浊仪进行测定，但白念和黑曲因为孢子较大，只能测出10的7次方，如果 ...

多少数值的7次方，如果是3左右，浓缩3~5倍。
个人认为7次方是可接受的，满足样品中5次方