小奕说药 | 硫醇-马来酰亚胺：ADC偶联的“黄金反应”，背后机理大揭秘！

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在化学的世界里，有一种神奇的反应，它就像拼图游戏一样，能够将不同的分子片段快速而精准地连接在一起。硫醇-马来酰亚胺反应则是其中的佼佼者。今天，我们就来深入探讨一下这种反应的奥秘。

1. 硫醇-马来酰亚胺反应

硫醇-马来酰亚胺反应是一种典型的迈克尔加成反应（Michael Addition）。硫醇（含有-SH基团的化合物）和马来酰亚胺（一种含有活性双键的化合物）在适当的条件下可以迅速反应，生成稳定的产物。这种反应因其高效性、选择性和生物相容性而被广泛应用于生物化学、材料科学和药物合成等领域。

2. 反应机制的探索

硫醇-马来酰亚胺反应的机制一直是化学家们研究的热点。传统的观点认为，这种反应主要通过碱催化或亲核催化两种途径进行。碱催化机制中，碱（如三乙胺）会夺取硫醇中的氢原子，形成硫醇负离子，然后这个负离子会攻击马来酰亚胺的双键，生成最终产物。而亲核催化机制则涉及亲核试剂（如含磷化合物）先与马来酰亚胺反应，生成一个两性中间体，再通过这个中间体夺取硫醇中的氢原子，形成硫醇负离子，进而催化完成反应。

图1. 传统硫醇-马来酰亚胺反应机理。（a）硫醇盐催化下硫醇与 N-马来酰亚胺反应的机制。（b) 通过酸碱平衡路径生成硫醇负离子。（c）遵循亲核试剂引发的路径生成硫醇负离子。

然而，最新的研究发现，反应的实际机制远比这复杂。通过计算化学和实验验证，发现反应的路径不仅取决于所使用的碱或亲核试剂，还与溶剂的性质密切相关。例如，在非极性溶剂中，反应更倾向于通过离子对机制进行，而非直接碱催化机制（图2）。

图2. 在氯仿（CHCl₃）中，三乙胺（Et₃N）催化甲硫醇（1）与N-甲基吗啉（NMM）加成反应的动力学模型结果。可以看出，在氯仿中离子对路径（黑线）的模型预测的烯烃转化率最高，而仅考虑酸碱路径（绿线）的模型预测对转化率几乎没有贡献。

所谓的离子对机制，是指碱催化剂在夺取硫醇质子后与其形成离子对，共同参与到与马来酰亚胺的加成反应里，而非直接解离出游离的硫醇负离子参与反应。如图3(a)所示，硫醇-三乙胺离子对直接解离出硫醇负离子的相对自由能 ΔG0为33.4 kcal/mol，而离子对途径(图3b-TS17)形成硫醇负离子的的总能垒 ΔG0为27.0 kcal/mol。变化自由能的差异可以解释在氯仿中吸热更少的离子对途径才是催化反应的主导路径。

图3. 在氯仿（CHCl₃）中，三乙胺（Et₃N）催化甲硫醇形成硫醇负离子的途径能量分析。（a)通过酸碱平衡途径直接去质子化解离出游离离子。（b）通过离子对途径从另一个硫醇夺取质子形成硫醇负离子。

3. 溶剂的影响

溶剂在化学反应中往往扮演着重要的角色。对于硫醇-马来酰亚胺反应来说，溶剂的极性对反应速率和选择性有着显著的影响。实验表明，在极性溶剂如N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，反应速率明显加快。这是因为极性溶剂能够更好地稳定反应中的负离子中间体，从而降低反应的活化能。

此外，极性溶剂还可以在没有碱的情况下促进反应进行。这是因为极性溶剂可以通过自身的极性基团与硫醇中的氢原子形成氢键，从而促进硫醇的去质子化，生成活性更高的硫醇负离子。这种现象在非极性溶剂中是很难实现的。

图4. 在三乙胺（Et₃N）催化下，不同溶剂DMF、CHCl₃ 和 EtSH 对烯烃转化率随时间变化的影响。可以看出，在DMF中，离子对路径被完全绕过，反应遵循直接脱质子机制。

4. 催化剂的选择

催化剂的选择对于硫醇-马来酰亚胺反应同样至关重要。不同的催化剂对反应的促进作用各不相同。例如，三乙胺是一种常用的碱性催化剂，它能够有效地促进硫醇的去质子化，从而加速反应的进行。然而，当使用更强的碱如1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷（DBU）时，反应的选择性会发生显著变化。

研究表明，DBU不仅能够通过碱催化机制促进反应，还可能通过亲核催化机制参与反应。这种双重作用使得DBU大大降低了反应能垒，降低了反应选择性，因此需要降低DBU浓度来提升反应的选择性。此外，一些非碱性催化剂如二甲基苯基膦（DMPP）也能够通过亲核催化机制促进反应，且反应速率非常快。

图5. 在氯仿中，五种不同催化剂（EtNH₂、Et₂NH、Et₃N、DBU 和 DMPP）在烯烃转化率随时间变化的曲线。可以看出，DMPP反应最快，因为其完全遵循亲核引发机制。DBU反应速率也很快，且是唯一能在氯仿中通过直接脱质子启动反应的氮中心碱催化剂。

5. 硫醇的选择性

硫醇的种类对反应的选择性也有着重要的影响。不同的硫醇在反应中的活性差异主要取决于它们的酸性（即pKa值）。一般来说，酸性越强的硫醇，其反应活性越高。这是因为酸性越强的硫醇越容易被碱去质子化，生成活性更高的硫醇负离子。

例如，硫酚的酸性比甲基硫醇更强，因此在与马来酰亚胺的反应中，硫酚的反应速率更快。此外，硫醇的结构也会影响其反应活性。例如，含有较长烷基链的硫醇（如己硫醇）通常比含有短链（甲硫醇）或芳香基团的硫醇反应速率慢。

图6. 常见的硫醇类型，甲硫醇 (1), β-巯基乙醇 (2), 硫代乙酸 (3), 甲基硫代乙酸酯 (4), 甲基3-巯基丙酸酯 (5), 半胱氨酸甲酯 (6), 苯硫酚 (7)。其直接脱质子形成负离子所需能量顺序为3 < 7 < 4 < 2 < 6 < 5 < 1。

6. 对ADC半胱氨酸偶联反应的启示

硫醇-马来酰亚胺反应作为一种高效的亲核加成化学反应，因其独特的优势在多个领域得到了广泛的应用。通过对反应机制的深入研究，不仅揭示了溶剂、催化剂和硫醇种类对反应的影响，还为设计和优化ADC偶联反应条件提供了理论依据。

01. 主要反应机理

在ADC偶联方式中，利用该机理的是抗体链间二硫键部分或全部还原后形成的巯基与小分子末端马来酰亚胺的反应。由于抗体需要溶解在水溶液中，水以及溶解在水中的缓冲盐可以接受巯基脱去的质子，因此酸碱平衡机制可能是主要的引发形式。

02. 影响反应的因素

在酸碱平衡机制中，巯基有效脱去质子是最关键的一步，对反应的效率和反应的选择性都有影响。适当提高反应的pH，有利于去质子化，使更多的巯基形成硫醇负离子，从而提高反应效率，减少小分子的用量。同时，由于抗体序列和微环境差异，导致铰链区和Fab端半胱氨酸巯基基团的pka不同，利用这种差异或者或者优化有机溶剂比例，能够帮助提高偶联的选择性，以更好的实现均质DAR（药物-抗体比）、提高稳定性与疗效。

03. TCEP的副反应

TCEP是常用的抗体二硫键还原剂，为了整个工艺流程的便捷性考虑，通常反应后直接进行偶联。但上述的反应机理揭示出TCEP中的磷原子可以通过亲核反应路径与马来酰亚胺发生副反应。因此TCEP还原反应需避免过多的使用量，减少对后续反应的干扰。

参考文献

[1] Thiol–maleimide “click” chemistry: evaluating the influence of solvent, initiator, and thiol on the reaction mechanism, kinetics, and selectivity. Brian H. Northrop, Stephen H. Frayne and Umesh Choudhary. Polym. Chem., 2015, 6, 3415.

[2] For a recent review of thiol-Michael reactions and their applications see: D. P. Nair, M. Podgórski, S. Chatani, T. Gong, W. Xi, C. R. Fenoli and C. N. Bowman, Chem. Mater., 2014, 26, 724–744.

[3] Evaluation of Factors Influencing Antibody Reduction for Development of Antibody Drug Conjugates. Abdollahpour-Alitappeh M, Lotfinia M, Razavi-Vakhshourpour S, Jahandideh S, Najminejad H, Sineh Sepehr K, et al. Iranian Biomedical Journal 21(4): 270-274 July 2017.

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