细胞计数方法验证

手指与手掌

请教各位老师，用CountStar细胞计数仪做细胞计数和活率的验证，需要做哪些项目呀？

世间始终你好

很好——下面给你一份面向 CountStar（自动细胞计数仪）用于细胞计数与活率验证 的可执行清单和建议检测方案（包含要做的项目、测试设计、样本/细胞类型、典型接受标准以及注意事项）。我把内容分成必做项（必须验证）和建议项（增强置信度／GMP 要求下常做），并给出具体的实验设计模板，方便直接写成 OQ/PQ 条目。

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一、验证框架（总体流程）

• IQ（安装确认）
  
  
  • 设备型号/序列号、出厂证书、硬件完整性、外观、供电、网络/接口、环境条件（温湿度）、配件/耗材到位。
    
  • 软件版本、许可证、用户权限配置、时钟校正。
    
  • 记录：设备清单、出厂合格证、安装记录、照片。
    
    
• OQ（运行确认） — 功能/性能项（下面细分测试）
  
  
  • 仪器功能、软件菜单、方法设置、图像采集、自动分析参数、报警/容错。
    
    
• PQ（性能确认/现场应用） — 过程相关性能
  
  
  • 在实际样本类型上验证计数/活率结果满足质量要求（与参考方法比对、重复性、准确度、线性等）。
    
    
• SOP / 维护 / 培训 / 数据完整性
  
  
  • 建立操作 SOP、维护/清洁记录、QC 日常运行（比如校准珠、空白检查）、操作人员培训记录、数据备份与审计追踪。
    
    

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二、必须做的验证项目（OQ + PQ 关键测试）下面每一项都建议形成独立 OQ/PQ 条目，包含目的、方法、样本、重复次数、接受标准、结果记录表格。

• 准确度（Accuracy）
  
  
  • 目的：仪器读数与参考方法（人工血球计数/血球计数板或经验证的参考仪器）的一致性。
    
  • 方法：同一样品同时用 CountStar 与人工血球计数（或经验证的参比仪）测三次以上；覆盖低、中、高细胞浓度（例如 1×10^4，1×10^5，1×10^6 cells/mL）。
    
  • 重复：每浓度至少 3 个平行样。
    
  • 接受标准（示例）：偏差 ≤ ±10%（或相关性 R² ≥ 0.98，斜率接近 1）。
    
  • 注意：对活率同时比对（参考台盼蓝/其他金标准染色法）。
    
    
• 精密度（Repeatability / Intermediate precision）
  
  
  • 目的：短期重复与不同条件下的一致性。
    
  • 方法：同一样品做重复测定：
    
    
    • 同一操作者、同一日、同一准备：重复 6 次（短期重复）。
      
    • 不同操作者、不同日（3 日）、不同批次耗材：每条件 3 次。
      
      
  • 指标：CV(重复) ≤ 5–10%（高细胞密度通常要求更低 CV，例如 ≤5%）；操作者/日间中间精密度 CV ≤10%。
    
    
• 线性与量程（Linearity & Range）
  
  
  • 目的：仪器在宣称范围内是否线性响应。
    
  • 方法：准备系列稀释样（至少 5 个点），从最低到最高（例如 1×10^3 ~ 1×10^7 cells/mL，或根据你常用范围）。每点 3 次测定。
    
  • 指标：回归线性 R² ≥ 0.99；偏差在可接受范围内（如±10%）。
    
  • 结果：确定下限（LLOQ）与上限（ULOQ）。
    
    
• 灵敏度 / LOD（Limit of Detection / Quantification）
  
  
  • 目的：最小可可靠检测/定量细胞浓度。
    
  • 方法：低浓度梯度，重复测定，定义 LOD（信噪比/标准偏差法）和 LLOQ（符合精密度/准确度要求的最低点）。
    
  • 指标示例：LLOQ 为能达到 CV ≤20% 且偏差 ≤20% 的最低点（依据内部定义）。
    
    
• 比对（Method Comparison）
  
  
  • 目的：与金标准方法或另一台经验证设备比对（Bland-Altman、回归分析）。
    
  • 方法：使用 ≥20 个临床/生产样本或混合细胞类型（不同大小/形态），分别测 CountStar 与参考法。
    
  • 指标：相关性好（R²≥0.95），Bland-Altman 平均偏差在可接受范围内（例如 ±10%）。
    
    
• 活率验证（Viability）
  
  
  • 目的：活/死区分的准确性与重复性（尤其 AO/PI、台盼蓝模式）。
    
  • 方法：制备已知活率混合样（用热杀、乙醇处理或冻融等手段制备 0%、25%、50%、75%、100% 活率样），每个点 3 次或更多。
    
  • 指标：测定活率偏差 ≤ ±5%（或内部规定）；线性相关性 R²≥0.98。
    
  • 注意：对不同染料/试剂的作用时间、浓度、采集延迟（stability）做确认。
    
    
• 稀释线性 / 稀释准确度（Dilutional Linearity）
  
  
  • 目的：样品稀释后结果是否线性恢复（重要用于高浓度样需稀释时）。
    
  • 方法：对高浓度样按 1:2、1:5、1:10 等进行稀释，测定回收率。
    
  • 指标：回收率在 90–110% 或偏差 ≤ ±10%。
    
    
• 检出范围内的细胞种类/基质效应（Matrix / Cell Type Effect）
  
  
  • 目的：不同细胞大小/形态（如 CHO、HEK293、PBMC、红细胞残留、碎片）对计数/活率的影响。
    
  • 方法：选至少 3 种代表性细胞（黏附细胞、悬浮细胞、血源细胞），重复做准确度/精密度/线性验证。
    
  • 指标：与参考法一致，或记录需要的特殊参数/门限调整。
    
    
• Carryover（残留/交叉污染）
  
  
  • 目的：高浓度样后是否影响低浓度样读数。
    
  • 方法：高浓度样（H）—低浓度样（L）交替运行多次（例如 H-L-H-L），计算残留百分比。
    
  • 指标：Carryover ≤ 1–2%（或按内部设定）。
    
    
• 稳定性（Sample/stain stability）
  
  
  • 目的：染色后或放置后样本结果随时间变化情况（上机前允许等待时间）。
    
  • 方法：染色后 0、5、15、30、60 分钟测定（或按实际流程时间点）。
    
  • 指标：活率/计数在允许时间内偏差 ≤ 5–10%。
    
    
• 图像质量与分析参数（Image acquisition / gating）
  
  
  • 目的：相机对焦、图像清晰度、自动门控是否正确分离细胞/碎片。
    
  • 方法：检查不同细胞/杂质条件下的图像，手动核验自动判读是否正确，记录必要的设置（阈值、大小过滤）。
    
  • 接受：人为判读与自动分析一致性高（例如 ≤5% 差异）。
    
    
• 软件与数据完整性验证
  
  
  • 目的：软件功能（保存、导出、用户权限、审计追踪、时间戳）符合 21 CFR Part11（若适用）或内部要求。
    
  • 方法：测试用户登录/登出、修改记录、审计日志导出、备份与恢复、时间同步。
    
  • 指标：所有关键动作有审计记录、权限管理正常。
    
    
• 维护/校准程序验证（Calibration & QC）
  
  
  • 项目：使用厂商校准珠/标准样做系统校准并记录，测试周期性 QC（空白、标准珠、已知浓度样）。
    
  • 接受：校准数据在规格内，仪器自检通过。
    
    

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三、建议的 PQ 实验设计模板（示例）（可直接拷贝到 OQ/PQ 文档）

• 样本/细胞类型：CHO（悬浮）、HEK293（贴壁转悬浮）、人 PBMC（分离）
  
• 浓度点：1×10^4、5×10^4、1×10^5、5×10^5、1×10^6 cells/mL（按实际业务范围调整）
  
• 重复：每点三次（同操作者）；重复日：3 天；操作者：2 人（交叉检验）
  
• 比较方法：血球计数板（人工计数）或经过验证的参比仪（写明型号）
  
• 测项：细胞浓度（cells/mL）、活率（%）、图像质量、运行时间、错误/报警记录
  
• 统计：计算平均值、标准差、CV%、偏差%、线性回归（斜率、截距、R²）、Bland-Altman 分析
  
• 接受准则（示例）：
  
  
  • 计数准确度偏差 ≤ ±10%（多数点）；
    
  • 重复性 CV ≤ 5%（高密度点）/ ≤10%（低密度点）；
    
  • 线性 R² ≥ 0.99；
    
  • 活率偏差 ≤ ±5%；
    
  • carryover ≤2%；
    
  • 图像判读与人工一致率 ≥ 95%。
    
    

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四、耗材 / 方法细节（活率染色相关）

• 染料：AO/PI（CountStar 常用）、台盼蓝（人工参考）
  
• 染色比例与时间：按厂商说明并验证（常见：AO/PI 混合 1:1，孵育 30–60 s）；验证不同孵育时间影响（参见“稳定性”项）。
  
• 仪器设置：曝光、阈值、最小/最大粒径过滤需记录在方法里（Method file）。
  
• 背景/碎片处理：通过图像核查确认仪器能将碎片/气泡与细胞区分，必要时调整门限。
  
  

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五、记录与报告

• 每项测试要求：目的、方法、样品、试验步骤、设备参数、原始数据（截图/图像）、统计分析、结论、是否接受、偏差处置措施。
  
• 建议把所有图像和分析结果截图并归档（便于稽查）。
  
• 建立例行 QC 表（每日/每班）：空白检查、标准珠、系统自检。
  
  

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六、常见问题与注意事项

• 细胞聚集/黏连 会导致计数偏差，必要时加 DNase 或使用温和振荡/重悬。
  
• 碎片与气泡 在图像上干扰，稀释/离心或过滤样品前检查。
  
• 不同细胞大小 可能需要分别建立方法/门限；在 SOP 中注明适用于哪些细胞类型。
  
• 操作人员培训 很关键：不同操作者对上样手法影响不小（例如上样速度、气泡引入）。
  
• 法规环境（GMP/GLP/ISO）下还需补充电子记录规范、访问控制和验证周期（例：年检）。