培养基适用性检查

焦小糖

请教培养基适用性遇到的问题
1.取各试验菌的新鲜培养物用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、pH 7.2无菌磷酸盐缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液，其中制备黑曲霉孢子悬液时缓冲液中可加入0.05%（g/ml）聚山梨酯80。这个适量怎么定义？
2.取金黄色葡萄球菌不大于100cfu的试验菌液多少ml，要加多少ml被检适用性的肠道菌增菌液体培养基呢？

世间始终你好

好——把两个问题分开、按步给出实用、可直接操作的答案和计算示例。

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1）“0.05%（g/ml）聚山梨酯80”的**“适量”**如何理解与配制建议首先澄清术语：文献或指南里写的 0.05%（w/v）（有时误写为 g/mL）通常是指 0.05 g/100 mL，等价于 0.0005 g/mL = 0.5 mg/mL。所以“0.05%”就是最终缓冲液中 每毫升含 0.5 mg Tween-80。
常用换算与常见体积的称量举例（逐位计算）：

• 目标浓度 = 0.05% = 0.05 g / 100 mL = 0.0005 g/mL = 0.5 mg/mL。
  
• 若配 10 mL 缓冲液：所需 Tween-80 = 0.5 mg/mL × 10 mL = 5 mg = 0.005 g。
  
• 若配 100 mL 缓冲液：所需 = 0.5 mg/mL × 100 mL = 50 mg = 0.05 g。
  
• 若配 1 L (1000 mL)：所需 = 0.5 mg/mL ×1000 mL = 500 mg = 0.5 g。
  
  

配制建议（实验室实操友好）：

• 优先做母液（便于精确与无菌操作）：配制 10%（v/v 或 w/v）Tween-80 母液（例如 10 g / 100 mL，用瓶口或磁力搅拌助溶），用 0.22 µm 滤器滤器灭菌，分装冷藏。
  
• 使用时按体积稀释：例如要在 100 mL 缓冲液中得到 0.05%，从 10% 母液取：所需体积 = 目标浓度 / 母液浓度 × 体积 = (0.05% / 10%) × 100 mL = 0.5 mL。
  
  
  • 逐位算：0.05/10 = 0.005；0.005×100 mL = 0.5 mL。
    
    
• 无菌/加入时机：缓冲液（或供制备孢子悬液的液体）通常先高压灭菌或制备并冷却到室温后，无菌地加入经 0.22 µm 过滤灭菌的 Tween-80 母液（推荐），避免直接将 Tween 在高温灭菌后加入以减少氧化或分解风险（虽多数情况下 autoclave 也可，但 aseptic 加入更稳妥）。
  
• 为何用 0.05%：此浓度常用于减少真菌孢子聚集、改善分散性，但过高可能影响菌落形成或后续增菌/计数，务必按规定浓度执行并在本实验体系做对照确认（无 Tween vs 0.05%）。
  
  

小贴士：

• 用于真菌孢子（如黑曲霉）时，Tween-80 能帮助分散孢子；但做菌落计数或适用性验证前，最好做对照确认 Tween 不干扰计数/选择性培养。
  
• 配置和保存母液时尽量避光、低温并标注配制/失效期（例如 1–3 个月，依据实验室 SOP）。
  
  

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2）“取金黄色葡萄球菌不大于100 cfu 的试验菌液多少 mL，要加多少 mL 被检适用性的肠道菌增菌液体培养基”——操作步骤与计算方法这里的关键点是：先确定原始菌悬液的浓度（CFU/mL）→用稀释方法得到目标接种量（≤100 CFU）→把已知体积接入已知体积的增菌液中。常见实践是把 **已知体积（如0.1–1.0 mL）**的低浓度接种液加入 10–100 mL 的液体培养基做增菌试验。下面给出通用步骤与多个具体数值示例，便于直接套用。
通用公式（逐位明确）

• 目标总 CFU（目标个数） = C_inoculum (CFU/mL) × V_inoculum (mL)。
  
• 所以要让目标 CFU ≤ 100：C_inoculum × V_inoculum ≤ 100。
  
• 若选择 V_inoculum（实验方便的体积），则必需将原液稀释到 C_inoculum ≤ 100 / V_inoculum。
  
  

推荐常用做法（便于计数和移液）

• 常取 V_inoculum = 1.0 mL（操作最方便）→ 那么需要的接种液浓度 ≤ 100 CFU/mL。
  
• 或取 V_inoculum = 0.1 mL (100 µL) → 需要接种液浓度 ≤ 1000 CFU/mL。
  
• 增菌液体培养基体积：常用 10 mL 或 100 mL，视方法而定（标准适用性测试常用 10 mL）。用 10 mL 更经济、便于快速检测。
  
  

具体例子（含逐位算式）举例 A（常见、推荐）

• 目标：在 10 mL 增菌液 中接入 ≤100 CFU 的 S. aureus；选择接种体积 1.0 mL（易操作）。
  
• 则需把工作接种液配成 ≤100 CFU/mL。
  
• 若原始菌悬液为 1.0×10^8 CFU/mL（常见高滴度），做稀释步骤：
  
  
  • 1:10^3 稀释得到 1.0×10^5 CFU/mL（逐位：1.0×10^8 ÷10^3 = 1.0×10^5）。
    
  • 再做 1:10^2 → 得 1.0×10^3 CFU/mL。
    
  • 再做 1:10 → 得 1.0×10^2 CFU/mL = 100 CFU/mL。
    （合计 10^6 倍稀释即可，但逐步稀释更可靠；每步都取 100 µL→9.9 mL 或 100 µL→900 µL，按实验室 SOP）
    
    
• 最终：从稀释后的 100 CFU/mL 中取 1.0 mL 加入 10 mL 增菌液 → 最终接入约 100 CFU。
  
  

举例 B（当只想取 100 µL）

• 目标：用 0.1 mL (100 µL) 接种体积加入 10 mL 增菌液；则需要接种液浓度 ≤ 1000 CFU/mL。
  
• 若稀释后得到 1.0×10^3 CFU/mL，从中取 0.1 mL → 0.1 × 1.0×10^3 = 100 CFU。
  
  

举例 C（若用 100 mL 增菌液）

• 若想用 1 mL 接种到 100 mL 增菌液（模拟大体积样品），仍按上面方法把接种液控制到 ≤100 CFU/mL。总体原则不变。
  
  

如何实际操作（步骤）

• 测定或估算原始菌悬液滴度（CFU/mL）：用平板计数法（稀释后铺板）确认原液浓度。不要直接凭 OD 估算最终接种量，除非你有已校准的 OD→CFU 曲线。
  
• 按需要进行十倍/百倍连续稀释，并做平板验证稀释后的某一步（例如稀释到 10^2–10^3 CFU/mL 时）以保证计算正确。
  
• 准备增菌液（例如 10 mL sterile enteric enrichment broth in sterile tube），预温至培养温度（若 SOP 要求）。
  
• 从稀释后合格的接种液中取定体积（0.1–1.0 mL）无菌接入增菌液。轻轻混匀。
  
• 并行做阴性/阳性对照（阴性：不接种；阳性：接入已知高浓度以确认培养基能促进增长）。
  
• 记录每一步的稀释倍数与理论CFU，并保留稀释计数平板做为接种确认（这是验证“≤100 CFU”是否实际到位的关键）。
  
  

关于“被检适用性的肠道菌增菌液体培养基”的体积建议

• 常用体积：10 mL（无菌管或小锥瓶）——便于操作与快速培养。
  
• 如需更接近工业/样品体积，可用 100 mL（锥瓶），但要相应调整接种量与稀释倍数以保持 ≤100 CFU 总入菌数。
  
  

其他注意事项（针对 S. aureus 与肠道菌）

• 若同时测试不同菌种，注意 缓冲液或 Tween-80 对不同菌的影响（见第1问）。
  
• 做适用性测试时最好 平行做接种后直接平板计数（或对稀释液做平板）以证实接种数目与培养结果一致。
  
• 纪录移液器准确度，避免用极小体积（如 <5 &#181;L）直接接种原液，因误差大。
  
  

不见猫骨头

第一个问题，加3~5ml就可以了
第二个问题，加菌量不超过体积的1%，一般做培养基适应性的时候肠道菌增菌液体培养基是10ml/支，你加0.1ml不大于100cfu的菌悬液就可以了