基因敲入 vs 过表达：该如何选择？

18054268871

在基因功能研究、细胞模型构建等实验中，你可能会陷入 “该用基因敲入还是过表达” 的疑惑中。两者虽都能实现目的基因的表达调控，但核心逻辑、应用场景和实验结果差异显著。小源今天就将从概念、应用、核心区别三方面展开，帮你快速理清两者的定位，找到更适合自己实验的技术方案。

一、两个技术的核心概念是什么？

1. 基因敲入（Gene Knock-in, KI）

简单说，基因敲入是把目的基因（或片段）精准 “镶” 进细胞基因组的特定位置。就像在一本固定页码的书中，精准插入一页新内容，且这页内容会跟着书的印刷同步传递，长期稳定存在。

它依赖 CRISPR-Cas9 等基因编辑工具，先在基因组靶位点切割出 DNA 双链断裂，再通过细胞的同源定向修复机制，让外源目的基因与基因组整合。最终目的基因会跟随细胞分裂稳定遗传，且通常会模拟内源基因的表达模式（比如受内源启动子调控）。

2. 基因过表达（Gene Overexpression）

基因过表达则是给细胞额外 “加” 一份或多份目的基因，让目的基因的表达量远超正常水平。好比给书额外夹了几张复印纸（目的基因载体），这些 “复印纸” 可能不会融入书的正文（基因组），但能独立发挥作用，让相关内容（基因产物）大量产生。

常用的方法是将目的基因构建到质粒、病毒（如慢病毒、腺病毒）等载体中，再通过转染 / 感染导入细胞。这些外源载体可能在细胞内游离存在，也可能随机整合到基因组中，最终目的基因会在强启动子（如 CMV、EF1α）的驱动下，大量表达蛋白。


二、各自的适用场景有哪些？

1. 基因敲入的核心应用

基因敲入的优势是 “精准、稳定、模拟内源”，适合以下场景：

构建 “标签化” 细胞 / 动物模型：比如在目的基因末端敲入荧光蛋白（GFP、mCherry）或蛋白标签（Flag、Myc），既能观察目的蛋白的定位、动态变化，又不影响其正常功能（因整合在基因组原位，受内源调控）。

疾病基因突变模拟：若要研究某类疾病的特定基因突变（如癌症中的 EGFR 突变、遗传病中的单碱基突变），可通过敲入突变型基因片段，构建与病理状态一致的模型，更贴近真实疾病机制。

长期稳定的功能研究：需要细胞传代几十代后，目的基因仍稳定表达时（如干细胞诱导分化、长期药效评估），敲入的目的基因因整合到基因组，不会随细胞分裂丢失，结果更可靠。

2. 基因过表达的核心应用

基因过表达的优势是 “快速、高效、易操作”，适合以下场景：

快速验证基因功能：比如初步研究 “某基因是否促进细胞增殖”，只需将该基因的过表达载体导入细胞，24-48 小时后就能检测表达量和细胞增殖变化，无需等待基因组整合，实验周期短。

弥补基因表达不足：若细胞内源目的基因表达量极低，无法满足实验需求（如某些信号通路关键基因），可通过过表达补充，让通路激活，便于后续机制研究。

短期蛋白制备或通路调控：比如需要大量获取目的蛋白（用于体外实验），或短期激活某条信号通路（如过表达 AKT 激活 PI3K 通路），过表达能快速实现 “高表达量”，且实验结束后可通过载体丢失（如质粒转染）恢复细胞原有状态。

应用于回补实验：利用CRISPR-Cas9做基因敲除（Gene Knockout）获得基因敲除细胞系纯合细胞后，分析相关的生物学表型，最后作为对照还需要将原敲除的基因回补会到细胞系中，以验证基因敲除后的表型恢复。


三、如何区分两者？

四、怎么选？3 个核心判断标准

在实际实验中，无需纠结 “哪个技术更好”，而是看 “哪个更适配实验目的”，可从以下 3 点判断：

1. 看 “表达水平”

需高表达目的基因的研究，比如蛋白大量制备、检测低丰度蛋白的下游信号通路，选过表达（操作简单，周期短）；

需精准控制表达水平的研究，比如模拟基因生理表达量（如正常生理功能验证），选基因敲入（虽周期长，但结果更稳定可靠）。

2. 看 “是否需要模拟内源表达”

若实验需要还原基因的正常表达模式（如研究目的蛋白的生理定位、与其他蛋白的相互作用），选基因敲入（原位整合，受内源调控，无过度表达干扰）；

若只需 “提高目的基因表达量”（如激活通路、补充低表达基因），不关心是否模拟内源，选过表达（强启动子驱动，表达量高，能快速达到实验目的）。

3. 看 “实验后续需求”

若后续需要做动物实验（如构建基因敲入小鼠），或需要进行单细胞测序、长期药效评估等，基因敲入的稳定性更能保证实验重复性；

若只是短期检测（如 Western blot 验证蛋白功能、流式检测细胞表型），过表达的快速性更有优势，且成本更低。

五、最常见的两个问题

Q1：过表达能替代敲入吗？比如想观察蛋白定位，用过表达不行吗？

不推荐。过表达可能导致 “假阳性定位”：比如目的蛋白正常应在细胞核表达，但过度表达时可能因折叠异常、运输不及时，堆积在细胞质中，导致定位判断错误；而敲入的目的基因受内源调控，表达量与生理状态一致，定位结果更真实。

若只是初步观察，过表达可作为快速筛选；但要得到可靠结论，建议后续用敲入模型验证。

Q2：基因敲入效率低，有没有折中方案？

若觉得敲入周期长、效率低，但又需要相对稳定的表达，推荐通过慢病毒感染法或核转染法将过表达载体转入细胞。后续可依据预先摸索的最佳药物筛选浓度对细胞进行筛选，直至空白组细胞完全死亡，即可获得目的基因稳定表达的细胞株。

源井生物自主研发的 EZ-OE™技术，与传统慢病毒法、转座子法不同，可实现基因组定点整合与单一拷贝表达，成本更低、周期更快！

六、总结

要知道基因敲入和过表达并不是 “替代关系”，而是 “互补关系”，不是只能选谁，不能选谁，如何选择还要看你的实验需求是什么：

追求精准、稳定、模拟生理状态，选基因敲入

追求快速、高效、短期高表达，选基因过表达

源井生物可以提供的帮助

不论您是选择基因敲入还是过表达，源井生物都可以助您高效推进科研、斩获成果。源井生物累计拥有超13000+基因编辑成功案例，已实现300+种细胞类型的基因编辑，丰富的基因编辑经验以及成熟稳定的实验平台，为您的科研项目保驾护航。

基因敲入服务

依托源井生物创新研发的 CRISPR 升级技术，让基因编辑效率较传统方法提升 10-20 倍，拥有大量成功案例，在超300种细胞中实现基因编辑。我们还提供7×24h技术支持服务，为您的实验成功提供稳妥保障，让科研无忧。

过表达服务

采用源井生物自主研发的EZ-OE™过表达技术，无需依赖病毒，可安全高效实现外源 DNA 的精确整合与稳定表达。全流程严格质量控制，通过 RT-qPCR 等多维度验证，确保目的基因有效表达。同时支持个性化定制，提供慢病毒感染、质粒电转等多种转染方式，灵活适配不同细胞类型的实验需求。