方法适用性

微醺ba3

请教各位老师，在做方法确认的时候，对菌株采取10倍稀释法，稀释至合适的浓度后采用涂皿法（0.1mL）的菌液去培养 观察稀释浓度是否符合要求 ，确定好适宜的浓度后做样品的方法适用性，采用的是注皿法，但是会出现菌的生长情况不符合预期要求 。
请问，稀释级确认采用涂皿法，但是方法适用性采用的注皿法 ，两个采用不一致会对菌的稀释浓度影响吗？如果不影响，那想请问有什么原因可能造成菌的生长情况不符合预期要求？
另外，在做方法适用性的时候，样品组 是要将适宜浓度的菌液加到样品中去混匀，再取1mL注皿？ 还是先取1mL样品，在另外加1mL的菌液，注皿？

环湖

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这确实是微生物方法适用性确认（也称方法学验证）中一个非常经典且关键的实操困惑。我们来逐一拆解和分析。


问题一：涂皿法与注皿法的差异是否影响稀释浓度的确认？

结论：会有显著影响，这是您实验结果不符合预期的最可能原因。

详细解释：
1.  原理差异：
       涂布法：将0.1mL菌液涂布在已凝固的平板表面。菌体只生长在培养基表层，对氧气需求高的细菌（如大部分需氧菌）生长更有利，且避免了热损伤。
       倾注法：将1mL菌液与熔化后冷却至约45℃的培养基混合，然后倾注成平板。菌体被包裹在培养基内部。这会对一些微需氧菌或对热敏感的菌株造成两个挑战：a) 内部氧分压较低；b) 接触45℃的培养基可能导致部分损伤或死亡。

2.  对计数结果的影响：
       对于同一份稀释菌液，倾注法得到的CFU数通常低于或等于涂布法。特别是对于对热敏感的菌株（如某些金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌），倾注法可能导致菌量显著下降（降低0.3-0.5个对数甚至更多）。
       您用涂布法确认了一个“适宜的浓度”（例如10⁻⁶稀释度，0.1mL涂布得到约100CFU）。当您用同一稀释度的菌液去做倾注法时，由于热损伤，实际混入平板中的存活菌数可能只有30-50CFU，甚至更低。

解决方案：
方法确认（确定适宜稀释度）所用的方法，必须与后续样品方法适用性所采用的方法完全一致。
   如果您样品检验计划用倾注法，那么在前期确定菌液工作浓度时，也必须使用倾注法进行预实验，重新确定哪一个稀释度能给出预期的菌落数（如50-200CFU）。
   这是一个必须纠正的关键步骤。

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问题二：还有哪些原因可能导致生长不符合预期？

即使方法统一了，仍可能出现问题，常见原因包括：

1.  菌株状态：
       使用的不是标准菌株的新鲜传代培养物（通常要求≤5代）。
       菌液制备后放置时间过长，未在2小时内使用。
2.  培养基和温度：
       方法适用性中使用的培养基批次与前期确认时不同。
       培养温度不准确或不稳定。
       倾注时培养基温度过高（>50℃）造成热损伤。
3.  中和效应（如果样品有抑菌性）：
       这是方法适用性的核心目的之一。样品中可能含有防腐剂、抗生素或特定pH环境，会抑制微生物生长。即使您加入了“适宜浓度”的菌，也可能被样品抑制而导致回收率不达标。
       这就需要进行 “中和/稀释法验证” ，确保您的样品处理液（如含中和剂的缓冲液）能有效中和样品的抑菌性。
4.  操作误差：
       菌液与样品混合不均匀。
       倾注时间间隔长，部分培养基在操作过程中凝固。

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问题三：样品组加菌的正确操作方式

结论：标准且推荐的操作是第一种——将菌液加到样品中去混匀。

详细解释和操作步骤：

正确操作（“产品-菌液混合法”）：
1.  取规定量的样品（例如10g或10mL）加入到适量的稀释液/中和剂中（如90mL的pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液），制成1:10的样品匀液。
2.  向此样品匀液中加入0.1mL - 1mL（通常为1mL）的适宜浓度（如50-100CFU/mL）的菌悬液。注意：这里的菌悬液浓度需要根据您最终取样体积重新计算，确保整个平板能长出目标菌落数。
3.  充分混合。这一步模拟了样品被微生物污染的真实情况，让菌体与样品成分（包括可能的抑菌成分）充分接触。
4.  从混合液中取出1mL，注入无菌平皿，再倾注培养基。这就是 “试验组” 。

为什么这样做？
   目的真实性：检验方法的目的是检测样品中可能含有的微生物。将菌直接加到样品中，最能模拟样品基质对微生物回收的影响（抑制或促进）。
   评估抑菌性：这是判断方法是否适用的关键。通过比较“试验组”与“菌液对照组”的回收率，可以判断样品是否有抑菌性，以及您的中和/稀释方法是否有效。

对照组设置（必不可少）：
1.  试验组：样品 + 菌液 → 处理 → 倾注培养。
2.  菌液对照组：不含样品，用等量的稀释液/中和剂代替样品，加入等量菌液 → 同样处理 → 倾注培养。用于计算本底回收率（应接近100%）。
3.  样品对照组：样品 + 无菌稀释液（不加菌）→ 处理 → 倾注培养。用于确认样品本身是否无菌。
4.  阴性对照组：只有无菌培养基，确认无菌操作。

可接受标准：
通常要求 “试验组”的回收率不低于“菌液对照组”的70%（如中国药典、USP等）。如果达不到，说明样品有抑菌性，需要改进样品处理方式（如增加中和剂种类、增大稀释倍数等）。

总结建议：
1.  立即统一方法：使用倾注法重新确定各试验菌株的“适宜工作稀释度”。
2.  规范加菌操作：采用“产品-菌液混合法”进行样品方法适用性试验。
3.  完善对照系统：严格设置试验组、菌液对照组、样品对照组和阴性对照组。
4.  关注中和有效性：如果试验组回收率低，重点考察样品处理液的中和能力。

机智鼠

在进行方法确认时，稀释级确认采用涂皿法和注皿法的不一致确实可能对菌的稀释浓度产生影响。这是因为涂皿法和注皿法在操作上存在差异，可能导致菌液的均匀性和接种量的不同。

关于菌的生长情况不符合预期要求的原因，可能有以下几点：

1. 培养条件不当：如温度、湿度或氧气供应不足等，都会影响菌的生长。

2. 培养基不适宜：不同的菌种需要特定的培养基，若使用不合适的培养基，可能会导致菌的生长受限。

3. 操作误差：如菌液稀释倍数不准确、接种量不一致等，都可能导致结果偏差。

在做方法适用性试验时，样品组的操作应为将适宜浓度的菌液加到样品中去混匀，再取1mL注皿。这样做可以确保菌液与样品充分混合，从而更准确地评估样品的微生物污染程度。

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羽遥

稀释级确认用涂皿、方法适用性用注皿，对菌的稀释浓度没影响；
菌生长不符合预期可能是菌活力不行、培养基有问题，或者样品对菌有抑制；
方法适用性做样品组是把适宜浓度菌液加到样品里混匀，再取 1mL 注皿，不是先取样品再加 1mL 菌液

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你可以买那种定量菌株，买你需要的菌量，直接稀释就能用，会好很多，涂布法和倾注法最好保持一致，会有差异，样品组是要要菌加到样品中