小奕说药 | 非对称构型双抗的同源二聚体控制策略

奕安济世生物药

前言

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双特异性抗体（简称双抗；Bispecific Antibody，BsAb），是通过重组DNA或细胞融合技术等生物技术制备的人工抗体，可以同时或先后特异性结合两种靶抗原或同一靶抗原的两个不同表位。目前已上市的双抗药物的药物主成分分子大多为非对称构型，同源二聚体是这类双抗产品中重要且特有的一类产品相关杂质/变体，是潜在关键质量属性（pCQA）。

ICH Q8（R2）将控制策略（Control Strategy）定义为：“根据当前对产品和工艺的了解， 为确保工艺性能和产品质量而计划进行的一系列控制。这些控制可包括与原料药以及药物制剂的材料和组分相关的参数和属性、设施和设备运行条件、过程控制、成品质量标准以及相关的监测和控制方法与频率”。

ICH Q8（R2）认为，制订控制策略的目的是确保能持续地生产出符合质量要求的产品，应确定和了解会影响产品质量的变异来源，并加以控制。了解变异来源及其对下游的工艺、操作、中间体和药物制剂质量的影响，有助于将控制移到上游并减少成品检验的需求。

笔者曾在前一篇小奕说药公众号文章中介绍了有关非对称构型双抗同源二聚体的各种分析方法的应用《非对称构型双抗的同源二聚体分析》，在首先合理选择适当的同源二聚体分析方法的基础上，本文以常用的受控Fab臂交换技术为例，就如何建立同源二聚体的控制策略进行简要的理论介绍和探讨。

同源二聚体的关键质量属性(CQA)评估

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在建立控制策略之前，需要先对所需关注的质量属性进行评估，以确定其关键性或非关键性。ICH Q8（R2）将CQA定义为：“应该在适当的限度、范围或分布之内的物理、化学、生物或微生物性质或特征，用以确保所需的产品质量”。CQA评估是贯彻质量源于设计（QbD）理念的药物研发活动中关键的基石之一（见图1），并且是一个长期持续性的活动，CQA的评估广度及深度取决于研发需求和所处的产品开发阶段。

图1. CQA评估（左虚线框）与控制策略（右虚线框）的关联

通常可以将质量属性分为以下四个类别：产品相关变异体、工艺相关杂质、原材料&可浸出物以及强制性CQA。常见的产品相关变异体有尺寸相关变异体、电荷相关变异体、氧化相关变异体、Fc糖基化变异体和结构变异体等。双抗的同源二聚体即属于一种二硫键连接或广义的半胱氨酸类型产品变异体。

对于不同的质量属性类别，CQA评估的策略及所用工具是不同的。产品相关变异体可采用制备或组分分离的方式先收集到，然后对其进行构效关系的深入研究以获得其对产品安全性（免疫原性和非免疫原性安全性）和有效性（生物学活性和PK/PD）的影响程度信息（如表1示例所示），再结合文献和平台经验及临床观察数据（如可能），最后使用风险评分工具（如风险排序和过滤工具RRF）进行打分，根据预设的评分标准判定该质量属性是否属于CQA。

表1. 常见质量属性对治疗性蛋白的安全性和有效性影响

同源二聚体可能影响双抗产品的生物学活性，如治疗A型血友病的艾美赛珠单抗（Emicizumab），其治疗作用的发挥依赖其完整且正确的分子结构，才能实现预期的治疗作用机制，即同时与Factor X和Factor IXa同时结合以促进Factor X和Factor IXa之间的相互作用（见图2），然后在磷脂膜上发挥Factor VIII模拟活性，以实现凝血的疗效。而其同源二聚体（Q-Homo或J-Homo）因为只能分别结合Factor X或Factor IXa，故无法发挥预期的生物学功能，因此同源二聚体的存在会降低产品的疗效。

图2. Emicizumab的分子结构、作用机制及同源二聚体结构简图

相比于双抗，同源二聚体可能有与靶点不同的结合能力。Hui-Min Zhang等的研究发现，双抗与其臼-臼同源二聚体（Hole-hole HD）对抗原的结合活性存在明显差别。由于双抗只有一个臂与抗原结合（单价结合），因此双抗相对于其同源二聚体（二价）显示只有约50%的结合活性。该研究观察到的结果（双抗的抗原结合活性为53%，见图3）证明了双抗及其同源二聚体的抗原结合活性存在差异。

图3. 臼-臼同源二聚体（-70 °C、pH 3.0和2–8 °C储存5个月）与其双抗(BsAb1)的抗原结合活性对比

除了观察到上述抗原结合活性差异外，该研究还通过FcRn亲和色谱分析了不同储存条件的臼-臼同源二聚体及其双抗样品，发现不同储存温度下的臼-臼同源二聚体样品存在2-3个色谱峰，而相比之下其双抗只有单一的色谱峰。这可能预示臼-臼同源二聚体与其双抗存在一定程度的FcRn亲和力差异，从而有可能会导致体内药代动力学的差异。

此外，同源二聚体的存在还可能影响双抗产品的安全性，尤其对于T细胞依赖性双特异性抗体（T-cell-dependent bispecific antibodies, TDB）这一类双抗产品。TDB通过结合T细胞表面受体（T cell receptor，TCR）复合物的抗CD3（aCD3）臂从而与T细胞结合。而aCD3同源二聚体（aCD3 HD）之所以具有显著的安全性风险问题，是因为它能够在没有靶细胞的情况下通过TCR二聚化激活T细胞。这种脱靶（也称为靶细胞非依赖性）T细胞活化可以诱导细胞因子分泌，从而引发非期望的患者体内的免疫反应。

因此，对于双抗的同源二聚体是否为CQA的评估，需要通过双抗产品及其同源二聚体的结构和作用机制等特征，结合实践数据综合加以分析。

另外值得一提的是，对于CQA评估的第一步即如何制备或收集同源二聚体，取决于该双抗的分子构建平台和分子的氨基酸序列（两个半分子的物理化学特性差异）等因素。如双抗产品采用受控Fab臂交换技术制备得到，则其半分子来源的两个母体单抗即为同源二聚体；如目标双抗为胞内组装的杵臼（Knob-in-Hole）结构，则需要通过选用适当的工艺中间样品并进行分离纯化以得到同源二聚体组分，或构建分别表达两种同源二聚体单抗的细胞株后进行制备收集。

如果同源二聚体被评估为CQA，则需要在系统的工艺开发和工艺表征研究中，通过合理的风险评估和对工艺的理解逐步建立其控制策略，以使其含量水平在生产工艺和最终的产品中能得到有效的控制，从而保证产品的质量。

同源二聚体的控制策略

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总体控制策略以单元操作的设计空间为基础，代表了一种科学和基于风险的方法，为实现所有产品质量目标提供了高度保证。为此，每个质量属性都有一个单独的控制策略，该策略基于控制元素的组合构建，包括工艺和程序控制以及基本原理测试策略。因此，它是代表整个工艺控制策略的单个控制策略的总和。

图4. 控制策略元素（红框）是基于将工艺理解（蓝框）与产品理解（黄框）联系起来的合理方法

总体控制策略是基于风险评估结果制定的，同时考虑到对产品和工艺的理解，以确保CQA始终保持在可接受范围内。总体控制策略包括测试（中间体、放行、表征/可比性和工艺监测）和控制（输入材料、程序和工艺参数）。测试和控制水平应与风险相称。常用的一种风险评估方法（FMEA风险评估法）可由CQA的关键级别、工艺能力（或CQA在给定步骤失败的概率）和检测到CQA失败的概率来确定，它们的乘积RPN（Risk Priority Number）数值大小代表了风险水平的高低（见图5）。

图5. 总体CQA风险评估

测试计划是总体控制策略的一部分，该策略考虑了质量属性关键性的评估和控制质量属性的工艺能力。测试可以包括常规监测、表征测试、中间体测试、稳定性测试或原材料测试。

并非所有高风险CQA都自动映射到测试，而所有低风险CQA也并非会自动排除在测试之外。例如，具有低至中等工艺能力的高风险质量属性通常需要中间体控制或质量标准测试，而具有高至极高工艺能力的高风险质量属性通常不需要测试。在后一种情况下，验证批次的验证测试可足以论证控制能力，因而在工艺验证之后不需要再进行测试。此外，具有极低或低关键性和中等至高工艺能力的质量属性也可能不需要测试。

每个单独质量属性的控制级别是根据该属性的关键性级别，以及对工艺持续交付符合每个属性验收标准的产品的能力的风险评估来确定的。根据此风险评估结果，通过选择适当的控制要素，来为每个质量属性制定合理的控制策略。各个控制策略的总和代表了该产品的总体工艺控制策略。

双抗的同源二聚体来源于原材料/中间体（如，采用受控Fab臂交换技术生产的双抗的母体单抗可视为原料或工艺中间体）、上游生产工艺或还原-氧化交换反应工艺，并在下游工艺的层析（如，离子交换层析、疏水层析，混合模式层析等）步骤中被逐步去除并控制在一定范围内；此外，暂无文献表明在原液/成品的储存过程中同源二聚体会进一步生成。因此，本文论述的同源二聚体的控制策略仅在原液生产工艺范围内讨论。探索控制同源二聚体水平的方法是进行风险评估和工艺表征研究，以确定影响同源二聚体产生和去除的工艺步骤和参数，然后定义设计空间和控制范围，以确保原液中的同源二聚体水平被控制在合理范围内。

以受控Fab臂交换（Controlled Fab-arm exchange, cFAE）技术（原理见图6）生产工艺（工艺流程简图见图5）为例，Aran F. Labrijn等人的研究表明Fab臂交换的孵育时间、孵育温度、所使用的还原剂类型和还原剂浓度都会影响Fab交换工艺的效率，从而影响两种母体单抗即两种同源二聚体的残留水平。一般情况下，得益于反应的高效率（反应产物中目标双抗的纯度可达95%以上），采用受控Fab臂交换技术生产的双抗中的残余同源二聚体较少；但两种母体单抗与目标双抗分子的理化性质差异大小将一定程度上决定前者作为后者产品相关杂质的去除难易，并会影响到同源二聚体在下游纯化步骤的控制策略。因此，需要对这些影响因素分别进行风险评估，以确定对交换效率/同源二聚体去除效率影响最大的工艺参数，然后在Fab臂交换和下游纯化工序的工艺表征研究中进行检查。在这些研究完成后，在最终的风险评估中对输入参数进行分类（关键工艺参数CPP，可控的关键工艺参数WC-CPP，重要工艺参数KPP，非重要工艺参数Non-KPP，等）。

图6. cFAE技术原理简图（该技术是一种通过将两种亲本单抗重组并形成稳定的异二聚体来产生双抗的有效过程。将两个匹配的点突变F405L和K409R分别引入两个亲本单抗的CH3结构域，并在温和的还原条件下，这些点突变驱动异二聚体双抗的形成，并在再氧化条件下锁定在最终构象中。与其他双抗制备方法相比，cFAE可以快速、恰当地生成双抗）

图7. cFAE技术生产非对称双抗的工艺流程简图

基于以上内容并限于篇幅，我们以受控Fab臂交换（cFAE）技术制备的非对称双抗产品为例，简单示例同源二聚体的总体控制策略（风险评估和控制策略的建立过程略），见下表：

表2. cFAE技术制备双抗中的同源二聚体总体控制策略示例*

*注：本表示例是基于文献知识的简要概论，非基于实际案例，受限于诸多因素，其参考价值请读者自辩。

总结

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非对称双抗产品中的同源二聚体可能会影响产品的安全性和有效性，因此后者是前者中的一类特有且重要的产品相关变体/杂质，是潜在的关键质量属性，可能需要通过建立系统的策略在生产工艺中加以控制。

不同技术平台构建的双抗产品，因每个分子独特的序列和结构及其所决定的物理化学特性、生产工艺等因素差别可能较大，需根据产品和生产工艺等特点及开发过程中逐步累积的经验进行渐进式的系统风险评估，并最终制定适用的控制策略，以保证产品中的同源二聚体在不同层面中能得到有效控制，并最终保证产品质量的一致性和工艺的稳健性。

后记

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在这篇文章撰写完成后，我的同事Simon在审稿时给了一些他的个人体会：对于分子量与目标双抗差异明显的同源二聚体，有可能在大小变异体的分析方法（如，CE-SDS）中同时观察到同源二聚体的分离，这种情况下可以借监控大小变异体的机会同时关注同源二聚体的百分比情况；而对于跟目标双抗的分子分子量差异较小的同源二聚体，除用于结构表征的质谱方法外，可能还需要开发特定的分析方法（如，基于疏水差异的HIC/RPLC）用于在工艺开发中有效监控同源二聚体，并结合这些方法的用途和特点，综合考量以制定适当的控制检测策略。

参考文献

[1] ICH Q8(R2). Pharmaceutical Development. 2009.

[2] Nadja Alt, et.al. Determination of critical quality attributes for monoclonal antibodies using quality by design principles. Biologicals. Volume 44, Issue 5, September 2016, Pages 291-305.

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