小奕说药 | 从发现到开发: 一个双特异性抗体的可开发性评估与优化全案解析

奕安济世生物药

研究背景

▪ 在分子发现阶段，一个由两个单克隆抗体X1和Y1组装而成的scFv-mAb格式的双特异性抗体分子X1Y1（图A）具有良好的表现被作为首选候选分子。经过一步纯化后，最终的蛋白收率大于200mg/L，SEC检测的纯度水平大于97%。

▪ 但在CMC阶段的15L生产过程中，protein A亲和层析后的洗脱液在搅拌条件下产品出现显著沉淀（图B） 。

▪ 更换不同的pH、缓冲液组成、赋形剂和表面活性剂，均对沉淀没有影响。此外，沉淀可以溶解在4M尿素中，说明沉淀可能是蛋白质。

图1. X1Y1在大规模生产中观察到絮状沉淀现象

(A) X1Y1双特异性抗体结构示意图。(B) 在CMC阶段进行大规模生产时，晃动或搅拌过程中持续观察到的絮状沉淀。

根本原因确定

▪ 对组成双抗的两种亲本单抗X1和Y1进行了单独研究，摇晃后，两种mAb均出现持续沉淀，表明它们共同参与了双抗的沉淀，其中单抗X1沉淀更为显著。

▪ 亲本抗体X1在HIC中的保留时间延长，表明X1的沉淀可能主要是由其表面疏水性引起的。抗体Y1的Tm1相对较低，表明Y1的问题可能是由较低的构象稳定性所致。

▪ X1Y1表现出与X1相似的保留时间延长，与Y1相似的较低Tm1，表明其沉淀可能是两种机制的综合效应。X1的沉淀水平显著高于Y1，表明其可能在bsAb的聚集中起主导作用。因此暂时假设抗体X1的表面疏水性是引起双抗X1Y1聚集的主要原因。

图2. 不同抗体沉淀水平的典型图片

表1. 双特异性抗体X1Y1及其亲本抗体的可开发性表征分析。所有样品均在浓度为1.5mg/mL的PBS缓冲液中进行分析。样品振荡后，沉淀水平定义为测量样品的相对浊度信号与野生型双特异性抗体X1Y1的比值。

X1Y1双抗中X1的定点突变

▪ 为了在分子水平上进一步了解X1的表面疏水性，构建了Fv区域的同源性模型，并对其进行了SAP分析。发现了两个显著的疏水斑块，在空间上相互接近。

▪ 序列和结构分析显示，其重链可变区（VH）的cdr中存在高疏水氨基酸。VH CDR3中的I100、L100a和VH CDR2中的F52、F53、I56被鉴定为影响疏水斑块的关键残基。

▪ 用疏水性较低的氨基酸取代这些残基可能有助于减少沉淀。

图3. X1的Fv同源模型及通过SAP分析鉴定出的疏水性区域

▪ 使用酪氨酸 (Y) 或组氨酸 (H) 替换VH CDR2 上的 F52 和 F53残基。

▪ 设计3和设计4分别在设计1的基础上加入额外的突变，以进一步增加亲水性。

表2. 基于X1的疏水性降低设计的可开发性表征分析。所有残基均采用Kabat编号。所有样品均在浓度为1.5mg/mL的PBS缓冲液中进行分析。样品振荡后，沉淀水平定义为测量样品的相对浊度信号与野生型双特异性抗体X1Y1的比值。

▪ 所有设计的HIC疏水性略有降低，所有突变体都降低了双抗的沉淀水平。

▪ FACS结合实验表明替代这些疏水残基可以缓解沉淀但会造成X1Y1 的结合能力大幅损失。

图4. 流式细胞术检测结果：靶向X1细胞的双特异性抗体中不同X1设计的结合情况

双抗中的靶点替换：以X2取代X1

▪ 使用与单抗X1具有相似的结合力和相似特征的单抗X2替代X1。

▪ 单独的X2和X2-scFv在摇晃后均未观察到沉淀。

▪ 新构建的双抗X2Y1与原始双抗X1Y1相比，沉淀行为虽有改善，但未完全解决问题，在振荡后仍有沉淀。

▪ 上述结果表明与抗体 Y1相关的稳定性问题可能是解决问题的关键。

图5. 不同抗体沉淀水平的典型图片

表3. 单克隆抗体X2、Y1，X2-scFv及双特异性抗体X2Y1的可开发性表征。所有样品均先在浓度为1.5mg/mL的PBS缓冲液中进行初始分析，亦测试了双特异性抗体X2Y1在制剂缓冲液中的情况。样品振荡后，沉淀水平定义为测量样品与野生型双特异性抗体X1Y1的相对浊度信号比值。

精准优化：针对Y1与双抗的理性设计策略

▪ 将Y1的可变序列与相似的同类抗体（同一性大于80%）进行了比对，将每个对齐框架位置上残基类型的出现频率进行统计排序，发现有六个位置的原始 Y1残基类型在比对中的频率≤50%，这表明这些位置可能存在潜在缺陷。

▪ 对原始残基进行硅突变，选择四个显示出能量改善的残基位置进行后续改造设计。

表4. Y1在与其高同源性种系序列比对中残基类型不占主导（出现频率≤50%）的位点。残基类型频率通过比对Y1与同源性>80%的密切关联种系序列在各对应位置的残基类型确定。

▪ 所有表达的突变体在 HIC 中的保留时间均无明显变化。由于所有突变都不在CDR区，因此抗原结合保持不变。

▪ 所有表达的设计都在一定程度上降低了 Y1聚合体水平。位于 VL 区域的 Design_5 (S7P) 和 Design_6 (T43A)都显示 Tm1 明显增加了 2℃ 以上，这证明它们成功地提高了构象稳定性。结合了这两个突变的 Design_9表现出了叠加效应，Tm1 提高到了 68.3℃，接近常规 IgG1 抗体的水平。相一致的是，Design_9 表现出最低的沉淀水平。

表5. 单克隆抗体Y1突变体的可开发性表征。所有残基均采用Kabat编号。样品均在浓度为1.5mg/mL的PBS缓冲液中进行分析。振荡后，沉淀水平以测量样品相对于野生型双特异性抗体X1Y1的相对浊度信号表示。

▪ 用经过稳定性改进的单抗Y1-e替代原双抗X2Y1中原来的Y1，虽然在PBS缓冲液中摇动样品后仍可看到极轻微的沉淀，但对比之前已得到明显改善。

▪ 通过更换配方缓冲液取代PBS缓冲液后，沉淀彻底消失。

表6. 优化后双特异性抗体的可开发性表征。所有样品均先以1.5mg/mL浓度在PBS缓冲液中进行测试，并于制剂缓冲液中进一步评估bsAb X2Y1-e。振荡后，样品沉淀水平定义为测量样品与野生型双特异性抗体X1Y1的相对浊度信号比值。

   

CMC阶段放大生产结果解析

▪ X2Y1-e被转移到CMC进行50L规模的生产。生产成功结束，总收率为61%，SEC纯度为98.4%。在整个生产过程中没有出现沉淀。

图6. CMC生产过程中X2Y1-e样品的典型外观

总结

搅拌引起的聚集被认为是抗体在空气-水界面上吸附和成核的结果，添加表面活性剂是缓解此类问题的常规方法。在本案例中，沉淀非常严重，传统的配方方法无法奏效，必须进行序列优化。针对表面疏水性和构象稳定性的工程改造是今后解决同类问题行之有效的参考方法。

参考文献

Wang S, Zhang W, Yang B, Zhang X, Fang J, Rui H, Chen Z, Gu J, Chen Z, Xu J. A case study of a bispecific antibody manufacturability assessment and optimization during discovery stage and its implications. Antib Ther. 2024 May 29;7(3):189-198. doi: 10.1093/abt/tbae013. Erratum in: Antib Ther. 2024 Aug 27;7(3):281.  

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溯流而上：《小奕说药》技术干货地图，一键直达！

2022-10-14

RioZhang

移液管当搅拌棒，这好像很不专业啊！

jscjyy

RioZhang 发表于 2026-1-8 10:46
移液管当搅拌棒，这好像很不专业啊！

这都被你发现了。

胜利者

学习

唐e3phf8pp

我们最近做的蛋白也有类似的情况，一换液就有类似丝状物出现，再换低浓度盐就澄清了