关于活菌相关的清洁验证如何进行？

菜鸟懒飞

概述，有一个产品是活菌制剂，现在要从菌种复苏、传代、原液制备、分装制剂这几个工序进行清洁验证，已知活菌为革兰氏阳性菌，蛋白质分子结构不明（活性成分是聚合物），如何进行清洁验证？
我认为的难点：
1、活菌无法回收或者微生物的回收率低，擦拭取样的回收率不好计算？
2、活性成分的分子结构不明，以TOC去换算，换算不出，TOC的标准只能以水的标准0.5ppm，或者以PDA TR49里面下游比较低的标准1~2ppm，是否可行？
3、无法计算TOC的回收，活菌本身的回收率也低，10ppm、千分之一的方法都不能用，有没有合理的解释，煎茶员会不会留缺陷？
4、虽然活菌为革兰氏阳性菌不产生内毒素，整个复苏和传代过程是专属培养基，是否还有不考察内毒素的其他合理理由？
大家有相关经验的，可以帮忙解答一下，谢谢！

wzzz2008

没做过制剂，
个人理解，活菌，重要的是灭活吧

世间始终你好

好 — 我把你的问题拆成两部分来回答：先给出一套**面向活菌制剂（革兰氏阳性、活性成分为未知聚合物）**的清洁验证总体思路 + 具体可操作的取样/回收/验收建议；然后针对你列出的四个“难点”逐条给出可行的技术与合规性解释、要做的验证实验与书面论证要点（包括如何用 TOC、微生物回收率修正、内毒素问题的合理论据等）。我会在关键结论处给出权威指南/文献作为支撑引用，方便你写验证方案时引用或在检查时出示。

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一、总体思路（原则与流程）

• 风险基于证据（risk-based）：把设备/工序按“接触产品的风险”（上游：菌种复苏/传代属于高生物负荷、下游：原液制备/分装靠近最终制剂）进行分级（worst-case 判定）。针对 worst-case 做最严格的验证；对低风险情形可放宽但需有论证。
  
• 多指标结合：活菌类残留用**可培养生物负荷（CFU）**或特异性微生物检测为主；对于“活性成分为未知聚合物”的化学残留，TOC 可作为常用通用指标，但必须做方法适用性/回收性试验并用风险评估论证接受限值（不可盲用通用值）。
  
• 取样方法以表面擦拭（swab）+ 漂洗(rinse)/冲洗）组合为主（针对无法回收的死角用冲洗），并严格验证取样物料（棉签/尼龙绒swab）、萃取效率与中和剂（对消毒剂的中和）。对微生物取样需使用含中和剂的培养基/缓冲液做 swab-to-broth。文献表明 swab 材料与萃取方式对回收率影响甚大，需实验确定最佳方案并据此修正接受值。
  
• 回收率修正与接受限：把对材料（用设备材质的 coupon）做回收研究，在不同脏污水平上（高/中/低）做回收率测定，得到设备-方法专属的回收因子（recovery factor）。在最终报告中用“校正后的检测限 = 方法检出限 / 回收率”或以“无菌/极低 CFU”作为目标并在验证报告中解释实际回收率如何影响结论。
  
• 生活化/可重复性：对擦拭人员、操作顺序、擦拭面积/方向、萃取体积等做 SOP 严格限定并在验证中考察人际差异（至少 3 人、每人多次）以保证方法稳健。
  
  

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二、针对你列出难点的逐条建议（可直接放进验证方案/答复检查员用）难点 1 — 活菌无法回收 / 微生物回收率低，擦拭回收率不好计算？建议与操作：

• 接受现实并以数据说明：先在设备材料（不锈钢、聚丙烯等）上做“模拟脏污 + 回收研究”（coupon 实验）。用目标菌（同株或代表性替代菌）在已知浓度下点涂/均匀涂布到 coupon 表面，待干燥（模拟实际残留状态）后按 SOP 用拟定的 swab 与萃取法取样并培养计数，计算回收率（%）。该回收率将用于修正现场擦拭结果或作为方法能力的证据。文献/行业实践即推荐此步骤。
  
• 选择合适的取样介质与 swab：推荐使用经验证的尼龙绒（flocked）swab + 中和剂/溶出缓冲（swab-to-broth），并验证不同 swab 品牌/批次的差异。若菌体易成团或紧贴表面，尝试用预湿 swab、并配合 rinse（冲洗）方法对比，选择回收率最高的方案。
  
• 用多点/多方法互证：对关键部位同时做 swab 和 rinse（或用压印/接触平板在平面处），若可能对比 qPCR（目标基因）或荧光染色法（总细胞计数）作为补充（但注意 qPCR 检出的是 DNA，不等于活菌）。这些互证数据能帮助解释“可培养 CFU 为何偏低但实际残留仍存在”的情况。
  
• 在验证报告中明确回收率的影响：如果回收率很低（例如 <10%），在报告中要把“校正后的实际残留估算”写清楚，说明虽然未检出或低检出但考虑回收率后残留仍低于风险可接受水平。监管机构通常接受以数据驱动的论证（前提是实验设计合理）。
  
  

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难点 2 — 活性成分分子结构不明，TOC 换算不可行，TOC 标准取 0.5ppm 或 PDA TR49 的 1~2ppm 是否可行？建议与操作：

• TOC 是通用工具，但必须做适用性验证：TOC 可作为“一把尺子”去量化有机残留，但不能凭空把某个 ppm 值套用上去。你需要做三类实验：
  a. 基线（blank）和系统灵敏度/检出限；
  b. 用工艺物料（或代表性替代物）做 TOC 加标回收实验（即在设备材质 coupon 上加已知量的产品/中间体或其近似替代物，干燥后按清洁取样并测 TOC，得回收率）；
  c. 把 TOC 结果与微生物/生物学指标联合评估（例如在高 TOC 条件下微生物 CFU 是否显著上升）。
  
• 关于数值（0.5、1–2 ppm）：PDA TR-49/行业常见做法通常给出“下游1–2 ppm、上游5–10 ppm”作为参考；但是这些值并非对所有生物制品都通用——必须通过风险评估（包括毒理学/剂量/产品暴露途径）和方法可行性来确定。你可以把 PDA 的 1–2 ppm 作为“出发值/参考值”，但务必在方案中写明：已进行加标回收/毒理/暴露评估后，确定最终接受限。引用 TR-49 支撑“可作为参考但需风险论证”的说法会更稳妥。
  
• 如果无法直接对未知聚合物做 TOC 加标：可选用替代策略：
  
  
  • 用“工艺物料总体母液”或冷冻浓缩的工艺样品做加标；
    
  • 若聚合物中含有可测的有机指示物（例如蛋白/多肽可测蛋白法），并行做蛋白法（BCA、Lowry、Ninhydrin 等）或特异性分析作为补充；
    
  • 把 TOC 与“功能性/生物学残留指标”（如单位表面积下的 CFU 或活性测定）联合作为放行依据。
    
    
• 方法报告中必有“方法适用性”（suitability）数据：TOC 方法的回收、检测下限、基线漂移、受设备多孔/表面影响等都需记录并在验证报告中解释。监管期望看到“不是盲用数字，而是有数据支撑的限度”。
  
  

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难点 3 — TOC 无法计算回收，活菌回收率也低，以千分之一方法/10 ppm 无法用，如何合理解释，检察员会不会留缺陷？建议与操作：

• 用数据代替主观断言：做充分的回收性/方法能力研究（多点、不同材质、不同脏污水平、多人操作），把回收率、变异系数、方法检出限（LOD/LOQ）写进报告。监管人员更看重实验数据和风险评估流程而不是你能否直接给出“千分之一”的数学换算。
  
• 采用“校正/修正后的限值”与“多指标证据”：例如：
  
  
  • Swab 方法 LOQ = 10 CFU/25 cm2，回收率 20%，则校正后的最小可检测实际残留为 50 CFU/25 cm2（用以估算 worst-case）。你应在报告中给出这类计算示例并据此说明“在 worst-case 下即使未检出，最大残留不超过 X，低于风险接受值 Y”。
    
  • 若 TOC 回收低，说明 TOC 不能单独使用；用 TOC + CFU + 设备冲洗液微生物测定作为联合证据，说明残留水平对下游产品安全/效力的风险可接受。
    
    
• 监管角度的沟通要点：在与检查员沟通时呈现：实验方案（含 coupon 回收）、数据（回收率/变异/LOD）、风险评估（为什么该残留浓度不会造成交叉污染/质量问题）、以及已实施的控制措施（专用设备/时间隔离/清洁程序）。这样通常能被接受，单纯说“回收率低所以无法计算”会被质疑，但“我们有数据并据此做风险评估”是可接受路径。
  
  

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难点 4 — 革兰氏阳性菌不产生内毒素，复苏/传代用专属培养基，是否还有不考察内毒素的其他合理理由？要点与建议：

• 内毒素（endotoxin，LPS）主要来自革兰氏阴性菌，革兰氏阳性细菌不产生 LPS。按常规，若产品与革兰氏阴性菌无交叉接触且生产环境不涉及革兰氏阴性菌，通常不需要常规做内毒素清洁验证。这在文献和 FDA 指南中是通行的.
  
• 但仍需考虑两点：
  a. 污染源：工厂历史上是否使用或可能接触革兰氏阴性菌（例如 E. coli）？若有交叉风险，需考虑内毒素风险；
  b. 其他可致热原因子：革兰氏阳性菌可产生其他能引起免疫反应或热原的分子（例如脂磷壁酸 / lipoteichoic acid，LTA），以及生产过程中可能残存的培养基成分或代谢产物，这些在某些最终制剂（尤其是注射剂）中可能构成风险。对于非注射、外用或口服剂型，热原/内毒素的风险评估会宽松一些。
  
• 建议的合规流程：
  
  
  • 在清洁验证的风险评估（RBA）里明确记录：菌种为革兰氏阳性、培养基成分、接触工艺、是否曾接触革兰氏阴性菌、最终产品剂型（是否为无菌/注射）等；
    
  • 如果最终产品为注射或存在静脉暴露，应考虑专门评估热原/内毒素（或做 LAL 测试）作为最终放行/验证的一部分；否则，通过文献与工艺隔离证明不涉及 LPS 产生，一般可不列入常规清洁指标，但要把风险评估与支持数据（菌种鉴定记录、厂区分区、历史监控）归档。
    
    

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三、给你的一套“可直接拿去写”的清洁验证框架（步骤 + 典型检测/接受值示例，供参考并要以风险评估调整）A. 最小实验集（验证阶段）

• 确定 worst-case 位置与工序（通常为复苏区/传代培养罐内壁/泵密封/与产品接触的阀门、分装针头等）。
  
• 开发并验证取样方法：coupon 实验（设备材质），swab-to-broth 条件（swab 型号、预湿溶液、中和剂、萃取体积、振荡/超声提取时间）、rinse 方法（冲洗体积/速度）。至少 3 个脏污浓度 + 3 个重复 + 多人操作。
  
• 微生物学测定：swab 后在含中和剂的培养基中培养计 CFU（TAMC，或特异菌计数）；同时做接触平板/压印对比分布。对关键取样点做富集以确认低水平残留可检出。
  
• TOC / 蛋白 / 其它化学指标：TOC（并行做加标回收），若怀疑蛋白存在并可被蛋白法检测则同时做 BCA/Lowry 等。
  
• 回收率计算：每种方法在每种材料上得出回收率（%）并计算方法 LOQ/LOD。
  
• 接受准则（示例，仅供参考，必须风险论证）：
  
  
  • 可培养微生物：无检出（0 CFU/25 cm&#178;，按方法检测限并加回收校正） 或 ≤1–10 CFU/25 cm&#178;（非无菌线可容许小量 CFU，但需基于产品风险）；
    
  • TOC：下游参考 1–2 ppm，若为上游/原料区可放宽到 5–10 ppm（仅作参考值，最终以方法适用性/加标回收/毒理/暴露评估决定）。
    
    

B. 运行监控（放行/例行）

• 每批次清洁后按 SOP 做点抽检（swab + TOC）；关键部位循环监控频率由风险评估决定（高风险每天/每班次，低风险周次）。
  
• 建立变异趋势图（长期数据）以发现漂移（趋势控制优于一次性“合格/不合格”）。
  
  

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四、检验方案中你应写清/能拿给检查员的关键文件（checklist）

• 风险评估（明确 worst-case、产品暴露途径、是否为注射/无菌产品）并引用 PDA TR-49 / FDA cleaning validation 作为方法学依据。
  
• 取样 SOP（swab 型号、溶液成分含中和剂、擦拭面积 25 cm&#178;、擦拭方式、萃取方法）。
  
• Coupon 回收性实验数据（材料、回收率、LOD/LOQ、变异系数）。
  
• TOC 方法适用性报告（blank、LOQ、回收、线性）与与 CFU 的联合解释。
  
• 对内毒素/热原是否做检测的风险评价与结论（并说明菌株属革兰氏阳性且历史不接触阴性菌的证据，或为什么需做 LAL 的理由）。
  
  

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五、可能遇到的监管问题及如何回答（示例语句）

• 检查员：“为什么你们用了 1 ppm TOC？”
  你可以答：「PDA TR-49 推荐下游常用参考值 1–2 ppm，且我们基于风险评估选择 1 ppm；更重要的，我们对设备材质做了 TOC 加标回收实验并证明在该限值下方法可检测到 worst-case 加标后的残留（见附件回收表）。」(Default)
  
• 检查员：“微生物取样回收率太低，结果可信度如何？”
  答：「我们已在代表性材质 coupon 上进行了回收研究，建立了回收因子；并以保守方式把方法检出限按回收因子换算为‘实际残留估计值’并据此做风险判断（见计算过程）。此外我们用 rinse + 富集来互证低水平残留。」(ASM Journals)
  
  

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六、快速行动清单（你交验方案/写 SOP 时可以直接照做）

• 制定风险评估（列出是否注射、是否与阴性菌接触、worst-case 列表）。
  
• 选择并采购 2–3 种 candidate swab（含尼龙绒），做 coupon 回收试验（3 个脏污水平、3 人、3 重复）。
  
• 做 TOC 方法验证（blank、LOD/LOQ、线性、加标回收）。用工艺样本或近似替代物做加标。
  
• 设计最终接受准则草案（微生物 + TOC 双指标），并写好解释路线（若一项不满足如何二次确认）。
  
• 把所有数据、计算示例放到验证报告里（检出限/回收/校正公式/风险结论）。
  
  

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七、参考（你可在方案中引用）

• PDA Technical Report No.49 — Points to Consider for Biotechnology Cleaning Validation（行业专文，给出 biotech 特有考量）。
  
• FDA — Guide to Inspections: Validation of Cleaning Processes（清洁验证监管思路与证据要求）。
  
• 文献：swab/rinse 回收研究与方法论（例如评价 swab/rinse 的论文与回收实践综述）。
  
• 行业讨论/综述：TOC 用于清洁验证的通用说明与实践（ISPE / 行业资料）。
  
  

Jonny--

这是AI回答的吗？
否则就是大神了

Lily_VIP

学习学习      

蜗牛爬爬

AI还是强

世间始终你好

Jonny-- 发表于 2025-10-9 17:02
这是AI回答的吗？
否则就是大神了

就是ai,chatgpt

zhjf

学习学习  

菜鸟懒飞

AI还是太全面了，其实重点就是第二点，如何是确认TOC，基本上的辅料占比不是那么高，检测限度有难度，其次TOC限度，轻微的差异就会导致TOC结果本身出现较大的偏差，最重要的问题是时间不多，有没有快速的方式，或者是先文字评估，后续做实际测试进行补充。

菜鸟懒飞

金币还有！大家没思路也可以领一领
还有一个是在DeepSeek得到的回答，虽然没有标明这些理由的来源，思路还是不错的，给大家分享一下
首先得理解他的深层需求——他需要一套既能科学合理又能通过检察官审核的方案，同时避免方法学上的死胡同。比如他提到活菌回收率低和TOC换算困难，其实是在担心无法建立可靠的检测标准。

用户可能没明说但隐含的需求是：如何在不破坏活菌特性的前提下，找到替代性的验证指标，并且这些指标要有权威依据（比如引用PDA或药典）。另外，他需要防御性的论证思路，万一被挑战能有理有据地回应。

第一个难点关于微生物回收率，确实不能照搬化学药的方法。可以考虑强调活菌制品的特殊性，转向杀灭效果验证而非物理清除。用生物指示剂和孢子挑战测试会更合理，这直接证明清洁程序能彻底消除微生物风险，反而比擦拭回收更彻底。

第二个难点TOC标准，用户纠结1-2ppm是否太宽松。需要考虑指出这不是成分残留而是系统清洁度证明，引用PDA TR29和GMP对注射用水的要求来佐证。如果担心标准高，可以用最差条件模拟残留物做回收率，但重点应放在TOC作为清洁控制的一般指标而非特定物残留。

第三个难点关于合理性解释，关键是要转变视角：从“证明绝对无残留”到“证明风险可控”。可以考虑组合三种证据——TOC证明化学清洁，生物指示剂证明微生物杀灭，培养基验证证明无交叉污染。这样即使单个方法有局限，整体数据也能形成证据链。

第四个难点内毒素，用户已经想到革兰氏阳性菌和不含动物源成分的理由，但需要更系统地排除。可以考虑补充工艺分析（比如发酵罐结构、温度条件）和直接检测数据，构建多层论证。

最后，用户可能需要实际案例参考，比如同类产品的申报经验，或者EMA/FDA对生物制品的相关指南。毕竟检察官更认可行业共识和既往成功实践。

您提出的这个问题非常专业且切中要害，确实是活菌制剂清洁验证中的核心难点。传统的基于化学残留物的验证思路在这里确实会遇到巨大挑战。下面我将针对您的四个难点，提供一套基于风险管理和科学逻辑的解决方案。

核心思路转变：从“化学残留”到“生物负载”和“交叉污染”控制
对于活菌产品，清洁验证的目标不应仅仅是去除化学分子，而是确保不会发生上一批次生产菌株或杂菌对下一批次的交叉污染。因此，我们的验证策略需要围绕这个核心目标来设计。

针对难点的逐条分析与解决方案
难点1：活菌回收率低，擦拭取样回收率不好计算
问题分析：
您说得对，活菌作为完整的微生物细胞，其从设备表面回收的效率远低于可溶性的化学分子。试图建立传统的“擦拭回收率”既困难，数据也不可靠。

解决方案：
放弃对活菌数量的精确回收率计算，转而采用“定性或半定量的生物负载检测”结合“清洁工艺的杀菌效果验证”。

取样与检测方法：

擦拭法+微生物培养法：仍然使用溶剂（如含中和剂的缓冲盐水）进行擦拭，但目的不是精确计算残留菌量，而是将擦拭液进行富集培养。

最终淋洗水法：收集清洁后的最终淋洗水，进行过滤和培养，或直接进行富集培养。

直接接触法：对于平坦表面，可使用RODAC平板等进行直接接触法取样。

可接受标准：

定性标准（首选且最科学）：擦拭液或淋洗水在专属培养基上进行富集培养后（例如，培养7天），无生产菌株生长。这是一个“是/否”的判定，完美地回答了“是否有活菌残留”这个核心问题，避免了回收率的困扰。

定量标准（如需要）：如果非要设定一个数值，可以参考洁净区环境微生物监控的标准，设定一个极低的限度，例如<1 CFU/每平方厘米或每25cm2。但这个方法的可靠性低于定性富集培养。

难点2 & 3：活性成分结构不明，TOC标准难定，且无法计算回收率
问题分析：
由于活性成分是聚合物且结构不明，使用TOC作为特异性指标确实存在换算困难、限度不合理的问题。10ppm和千分之一剂量法是基于化学药毒理学的，在此不适用。

解决方案：
将TOC作为“清洁效果确认指标”而非“产品残留定量指标”，并为其设定基于工艺能力的科学限度。

TOC的角色定位： TOC在这里用于证明清洁程序能够有效地去除设备表面的有机物总负荷（包括培养基成分、菌体代谢产物、细胞碎片等），证明设备达到了“化学清洁”状态。

TOC限度的制定依据（合理化路径）：

基于产品共用的安全风险：如果后续生产的产品是用于同一患者的其他活菌制剂，风险相对可控。但如果后续生产的是化学药或用于免疫低下人群的药品，则风险较高。

基于工艺能力（最推荐）：执行至少3次连续成功的清洁验证批次。在清洁后，对所有接触表面进行擦拭取样和/或取最终淋洗水测TOC。计算所有TOC结果的平均值和标准偏差。

可接受标准可以设定为：平均值 + 3 SD 或 平均值 + 2 SD，且此值必须低于一个基于风险设定的安全阈值。

基于安全阈值：您提到的0.5ppm（注射用水标准）过于严苛。参考PDA TR49及ISPE指南，对于下游工艺或非直接产品接触的环节，1-2 ppm是一个广泛接受且科学的限度。您可以这样论证：

该限度远高于大多数高毒性化学药物的计算限度，对于主要为培养基成分和菌体蛋白的残留而言，安全性是充分保障的。

该限度代表了优良的清洁工艺水平，能够有效防止任何可见残留物和交叉污染。

放弃TOC回收率：鉴于残留物成分复杂且不确定，可以不进行传统的TOC回收率实验。取而代之的是，在验证方案中说明：TOC用于监测总有机碳的清除趋势，其标准是基于工艺能力制定的，目的是证明清洁过程的一致性和有效性。

难点4：不考察内毒素的合理理由
问题分析：
您的理由已经非常充分，可以进行系统化阐述。

解决方案：
在验证方案中专门开辟一节进行“内毒素测试的合理性说明”，内容包括：

菌种特性：明确声明生产菌种为革兰氏阳性菌，其细胞壁成分主要为肽聚糖和磷壁酸，不产生内毒素（脂多糖）。

培养基成分：详细列出所有培养基配方，证明其不含任何动物源性成分（如胰蛋白胨通常来源于植物或微生物发酵），且所有化学组分均不引入内毒素。

工艺过程分析：

复苏和传代：这些阶段不涉及引入内毒素的步骤。

原液制备和分装：整个生产过程在受控环境下进行，使用经过验证的、低内毒素的物料和组件。

补充证据（增强说服力）：

可以提供关键原辅料的内毒素检测报告（COA）。

可以在工艺验证或日常监测中，对原液或成品进行内毒素检测，用历史数据来证明其水平远低于标准要求（例如，<0.25 EU/mL）。

结论：基于以上分析，生产系统中不存在内毒素污染源，因此在本品的清洁验证中，无需将内毒素作为验证指标。

总结：给检察官看的完整论证逻辑
当检察官提出质疑时，您可以遵循以下逻辑进行阐述：

识别特殊性：首先承认本品是活菌制剂，其清洁验证不能完全套用化学药的模式。

明确验证目标：我们的核心目标是防止活菌的交叉污染和确保设备达到化学清洁状态。

针对性策略：

对于活菌残留：我们采用基于专属培养基的富集培养法进行定性检测。该方法直接、专属性强，完美规避了回收率问题，并能最灵敏地检测出是否有活菌残留。

对于有机物残留：我们采用TOC作为清洁效果的指示工具。其限度（如1-2 ppm）是基于行业指南（PDA TR49）和本工艺的清洁能力制定的，该标准足以保证设备洁净，并防止任何有风险的残留。

对于内毒素：我们进行了全面的风险评估，从菌种特性、物料来源和工艺过程三个方面，证明了内毒素在本产品的生产系统中不是一项风险，因此无需检测。

通过这套组合拳，您不仅解决了技术难题，更展现了一个基于科学和风险管理的质量体系，这恰恰是监管机构最希望看到的。即使某些方法非传统，但只要论证充分、科学合理，检察官是完全可以接受的，不会留下重大缺陷。

环湖

不看题目，就是来拿金币的

Afun

感谢分享，学习一下

莞吖菍

领个金币                           

cwsun@163.com

学习学习！！！！！

cwsun@163.com

学习！！！！！！！！！！！

tpqzerking01

1 全部采用一次性 抛弃型 物品生产
2 专线生产

菜鸟懒飞

tpqzerking01 发表于 2025-10-14 14:54
1 全部采用一次性 抛弃型 物品生产
2 专线生产

1、目前来说这种方式的风险最小，但是新容器的相容性试验，还有对细菌培养的影响需要重新确认，目前无法实现
2、已经是专线生产，所以上述虽然有难点，但是总体的风险没有那么高，生物制药基本都是专线

MrWuvks

就是来拿金币的

一指拈花

谢谢楼主，来领金币

lipi

感谢分享，学习一下