关于活菌相关的清洁验证如何进行？

菜鸟懒飞

概述，有一个产品是活菌制剂，现在要从菌种复苏、传代、原液制备、分装制剂这几个工序进行清洁验证，已知活菌为革兰氏阳性菌，蛋白质分子结构不明（活性成分是聚合物），如何进行清洁验证？
我认为的难点：
1、活菌无法回收或者微生物的回收率低，擦拭取样的回收率不好计算？
2、活性成分的分子结构不明，以TOC去换算，换算不出，TOC的标准只能以水的标准0.5ppm，或者以PDA TR49里面下游比较低的标准1~2ppm，是否可行？
3、无法计算TOC的回收，活菌本身的回收率也低，10ppm、千分之一的方法都不能用，有没有合理的解释，煎茶员会不会留缺陷？
4、虽然活菌为革兰氏阳性菌不产生内毒素，整个复苏和传代过程是专属培养基，是否还有不考察内毒素的其他合理理由？
大家有相关经验的，可以帮忙解答一下，谢谢！

wzzz2008

没做过制剂，
个人理解，活菌，重要的是灭活吧

世间始终你好

好 — 我把你的问题拆成两部分来回答：先给出一套**面向活菌制剂（革兰氏阳性、活性成分为未知聚合物）**的清洁验证总体思路 + 具体可操作的取样/回收/验收建议；然后针对你列出的四个“难点”逐条给出可行的技术与合规性解释、要做的验证实验与书面论证要点（包括如何用 TOC、微生物回收率修正、内毒素问题的合理论据等）。我会在关键结论处给出权威指南/文献作为支撑引用，方便你写验证方案时引用或在检查时出示。

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一、总体思路（原则与流程）

• 风险基于证据（risk-based）：把设备/工序按“接触产品的风险”（上游：菌种复苏/传代属于高生物负荷、下游：原液制备/分装靠近最终制剂）进行分级（worst-case 判定）。针对 worst-case 做最严格的验证；对低风险情形可放宽但需有论证。
  
• 多指标结合：活菌类残留用**可培养生物负荷（CFU）**或特异性微生物检测为主；对于“活性成分为未知聚合物”的化学残留，TOC 可作为常用通用指标，但必须做方法适用性/回收性试验并用风险评估论证接受限值（不可盲用通用值）。
  
• 取样方法以表面擦拭（swab）+ 漂洗(rinse)/冲洗）组合为主（针对无法回收的死角用冲洗），并严格验证取样物料（棉签/尼龙绒swab）、萃取效率与中和剂（对消毒剂的中和）。对微生物取样需使用含中和剂的培养基/缓冲液做 swab-to-broth。文献表明 swab 材料与萃取方式对回收率影响甚大，需实验确定最佳方案并据此修正接受值。
  
• 回收率修正与接受限：把对材料（用设备材质的 coupon）做回收研究，在不同脏污水平上（高/中/低）做回收率测定，得到设备-方法专属的回收因子（recovery factor）。在最终报告中用“校正后的检测限 = 方法检出限 / 回收率”或以“无菌/极低 CFU”作为目标并在验证报告中解释实际回收率如何影响结论。
  
• 生活化/可重复性：对擦拭人员、操作顺序、擦拭面积/方向、萃取体积等做 SOP 严格限定并在验证中考察人际差异（至少 3 人、每人多次）以保证方法稳健。
  
  

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二、针对你列出难点的逐条建议（可直接放进验证方案/答复检查员用）难点 1 — 活菌无法回收 / 微生物回收率低，擦拭回收率不好计算？建议与操作：

• 接受现实并以数据说明：先在设备材料（不锈钢、聚丙烯等）上做“模拟脏污 + 回收研究”（coupon 实验）。用目标菌（同株或代表性替代菌）在已知浓度下点涂/均匀涂布到 coupon 表面，待干燥（模拟实际残留状态）后按 SOP 用拟定的 swab 与萃取法取样并培养计数，计算回收率（%）。该回收率将用于修正现场擦拭结果或作为方法能力的证据。文献/行业实践即推荐此步骤。
  
• 选择合适的取样介质与 swab：推荐使用经验证的尼龙绒（flocked）swab + 中和剂/溶出缓冲（swab-to-broth），并验证不同 swab 品牌/批次的差异。若菌体易成团或紧贴表面，尝试用预湿 swab、并配合 rinse（冲洗）方法对比，选择回收率最高的方案。
  
• 用多点/多方法互证：对关键部位同时做 swab 和 rinse（或用压印/接触平板在平面处），若可能对比 qPCR（目标基因）或荧光染色法（总细胞计数）作为补充（但注意 qPCR 检出的是 DNA，不等于活菌）。这些互证数据能帮助解释“可培养 CFU 为何偏低但实际残留仍存在”的情况。
  
• 在验证报告中明确回收率的影响：如果回收率很低（例如 <10%），在报告中要把“校正后的实际残留估算”写清楚，说明虽然未检出或低检出但考虑回收率后残留仍低于风险可接受水平。监管机构通常接受以数据驱动的论证（前提是实验设计合理）。
  
  

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难点 2 — 活性成分分子结构不明，TOC 换算不可行，TOC 标准取 0.5ppm 或 PDA TR49 的 1~2ppm 是否可行？建议与操作：

• TOC 是通用工具，但必须做适用性验证：TOC 可作为“一把尺子”去量化有机残留，但不能凭空把某个 ppm 值套用上去。你需要做三类实验：
  a. 基线（blank）和系统灵敏度/检出限；
  b. 用工艺物料（或代表性替代物）做 TOC 加标回收实验（即在设备材质 coupon 上加已知量的产品/中间体或其近似替代物，干燥后按清洁取样并测 TOC，得回收率）；
  c. 把 TOC 结果与微生物/生物学指标联合评估（例如在高 TOC 条件下微生物 CFU 是否显著上升）。
  
• 关于数值（0.5、1–2 ppm）：PDA TR-49/行业常见做法通常给出“下游1–2 ppm、上游5–10 ppm”作为参考；但是这些值并非对所有生物制品都通用——必须通过风险评估（包括毒理学/剂量/产品暴露途径）和方法可行性来确定。你可以把 PDA 的 1–2 ppm 作为“出发值/参考值”，但务必在方案中写明：已进行加标回收/毒理/暴露评估后，确定最终接受限。引用 TR-49 支撑“可作为参考但需风险论证”的说法会更稳妥。
  
• 如果无法直接对未知聚合物做 TOC 加标：可选用替代策略：
  
  
  • 用“工艺物料总体母液”或冷冻浓缩的工艺样品做加标；
    
  • 若聚合物中含有可测的有机指示物（例如蛋白/多肽可测蛋白法），并行做蛋白法（BCA、Lowry、Ninhydrin 等）或特异性分析作为补充；
    
  • 把 TOC 与“功能性/生物学残留指标”（如单位表面积下的 CFU 或活性测定）联合作为放行依据。
    
    
• 方法报告中必有“方法适用性”（suitability）数据：TOC 方法的回收、检测下限、基线漂移、受设备多孔/表面影响等都需记录并在验证报告中解释。监管期望看到“不是盲用数字，而是有数据支撑的限度”。
  
  

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难点 3 — TOC 无法计算回收，活菌回收率也低，以千分之一方法/10 ppm 无法用，如何合理解释，检察员会不会留缺陷？建议与操作：

• 用数据代替主观断言：做充分的回收性/方法能力研究（多点、不同材质、不同脏污水平、多人操作），把回收率、变异系数、方法检出限（LOD/LOQ）写进报告。监管人员更看重实验数据和风险评估流程而不是你能否直接给出“千分之一”的数学换算。
  
• 采用“校正/修正后的限值”与“多指标证据”：例如：
  
  
  • Swab 方法 LOQ = 10 CFU/25 cm2，回收率 20%，则校正后的最小可检测实际残留为 50 CFU/25 cm2（用以估算 worst-case）。你应在报告中给出这类计算示例并据此说明“在 worst-case 下即使未检出，最大残留不超过 X，低于风险接受值 Y”。
    
  • 若 TOC 回收低，说明 TOC 不能单独使用；用 TOC + CFU + 设备冲洗液微生物测定作为联合证据，说明残留水平对下游产品安全/效力的风险可接受。
    
    
• 监管角度的沟通要点：在与检查员沟通时呈现：实验方案（含 coupon 回收）、数据（回收率/变异/LOD）、风险评估（为什么该残留浓度不会造成交叉污染/质量问题）、以及已实施的控制措施（专用设备/时间隔离/清洁程序）。这样通常能被接受，单纯说“回收率低所以无法计算”会被质疑，但“我们有数据并据此做风险评估”是可接受路径。
  
  

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难点 4 — 革兰氏阳性菌不产生内毒素，复苏/传代用专属培养基，是否还有不考察内毒素的其他合理理由？要点与建议：

• 内毒素（endotoxin，LPS）主要来自革兰氏阴性菌，革兰氏阳性细菌不产生 LPS。按常规，若产品与革兰氏阴性菌无交叉接触且生产环境不涉及革兰氏阴性菌，通常不需要常规做内毒素清洁验证。这在文献和 FDA 指南中是通行的.
  
• 但仍需考虑两点：
  a. 污染源：工厂历史上是否使用或可能接触革兰氏阴性菌（例如 E. coli）？若有交叉风险，需考虑内毒素风险；
  b. 其他可致热原因子：革兰氏阳性菌可产生其他能引起免疫反应或热原的分子（例如脂磷壁酸 / lipoteichoic acid，LTA），以及生产过程中可能残存的培养基成分或代谢产物，这些在某些最终制剂（尤其是注射剂）中可能构成风险。对于非注射、外用或口服剂型，热原/内毒素的风险评估会宽松一些。
  
• 建议的合规流程：
  
  
  • 在清洁验证的风险评估（RBA）里明确记录：菌种为革兰氏阳性、培养基成分、接触工艺、是否曾接触革兰氏阴性菌、最终产品剂型（是否为无菌/注射）等；
    
  • 如果最终产品为注射或存在静脉暴露，应考虑专门评估热原/内毒素（或做 LAL 测试）作为最终放行/验证的一部分；否则，通过文献与工艺隔离证明不涉及 LPS 产生，一般可不列入常规清洁指标，但要把风险评估与支持数据（菌种鉴定记录、厂区分区、历史监控）归档。
    
    

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三、给你的一套“可直接拿去写”的清洁验证框架（步骤 + 典型检测/接受值示例，供参考并要以风险评估调整）A. 最小实验集（验证阶段）

• 确定 worst-case 位置与工序（通常为复苏区/传代培养罐内壁/泵密封/与产品接触的阀门、分装针头等）。
  
• 开发并验证取样方法：coupon 实验（设备材质），swab-to-broth 条件（swab 型号、预湿溶液、中和剂、萃取体积、振荡/超声提取时间）、rinse 方法（冲洗体积/速度）。至少 3 个脏污浓度 + 3 个重复 + 多人操作。
  
• 微生物学测定：swab 后在含中和剂的培养基中培养计 CFU（TAMC，或特异菌计数）；同时做接触平板/压印对比分布。对关键取样点做富集以确认低水平残留可检出。
  
• TOC / 蛋白 / 其它化学指标：TOC（并行做加标回收），若怀疑蛋白存在并可被蛋白法检测则同时做 BCA/Lowry 等。
  
• 回收率计算：每种方法在每种材料上得出回收率（%）并计算方法 LOQ/LOD。
  
• 接受准则（示例，仅供参考，必须风险论证）：
  
  
  • 可培养微生物：无检出（0 CFU/25 cm&#178;，按方法检测限并加回收校正） 或 ≤1–10 CFU/25 cm&#178;（非无菌线可容许小量 CFU，但需基于产品风险）；
    
  • TOC：下游参考 1–2 ppm，若为上游/原料区可放宽到 5–10 ppm（仅作参考值，最终以方法适用性/加标回收/毒理/暴露评估决定）。
    
    

B. 运行监控（放行/例行）

• 每批次清洁后按 SOP 做点抽检（swab + TOC）；关键部位循环监控频率由风险评估决定（高风险每天/每班次，低风险周次）。
  
• 建立变异趋势图（长期数据）以发现漂移（趋势控制优于一次性“合格/不合格”）。
  
  

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四、检验方案中你应写清/能拿给检查员的关键文件（checklist）

• 风险评估（明确 worst-case、产品暴露途径、是否为注射/无菌产品）并引用 PDA TR-49 / FDA cleaning validation 作为方法学依据。
  
• 取样 SOP（swab 型号、溶液成分含中和剂、擦拭面积 25 cm&#178;、擦拭方式、萃取方法）。
  
• Coupon 回收性实验数据（材料、回收率、LOD/LOQ、变异系数）。
  
• TOC 方法适用性报告（blank、LOQ、回收、线性）与与 CFU 的联合解释。
  
• 对内毒素/热原是否做检测的风险评价与结论（并说明菌株属革兰氏阳性且历史不接触阴性菌的证据，或为什么需做 LAL 的理由）。
  
  

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五、可能遇到的监管问题及如何回答（示例语句）

• 检查员：“为什么你们用了 1 ppm TOC？”
  你可以答：「PDA TR-49 推荐下游常用参考值 1–2 ppm，且我们基于风险评估选择 1 ppm；更重要的，我们对设备材质做了 TOC 加标回收实验并证明在该限值下方法可检测到 worst-case 加标后的残留（见附件回收表）。」(Default)
  
• 检查员：“微生物取样回收率太低，结果可信度如何？”
  答：「我们已在代表性材质 coupon 上进行了回收研究，建立了回收因子；并以保守方式把方法检出限按回收因子换算为‘实际残留估计值’并据此做风险判断（见计算过程）。此外我们用 rinse + 富集来互证低水平残留。」(ASM Journals)
  
  

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六、快速行动清单（你交验方案/写 SOP 时可以直接照做）

• 制定风险评估（列出是否注射、是否与阴性菌接触、worst-case 列表）。
  
• 选择并采购 2–3 种 candidate swab（含尼龙绒），做 coupon 回收试验（3 个脏污水平、3 人、3 重复）。
  
• 做 TOC 方法验证（blank、LOD/LOQ、线性、加标回收）。用工艺样本或近似替代物做加标。
  
• 设计最终接受准则草案（微生物 + TOC 双指标），并写好解释路线（若一项不满足如何二次确认）。
  
• 把所有数据、计算示例放到验证报告里（检出限/回收/校正公式/风险结论）。
  
  

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七、参考（你可在方案中引用）

• PDA Technical Report No.49 — Points to Consider for Biotechnology Cleaning Validation（行业专文，给出 biotech 特有考量）。
  
• FDA — Guide to Inspections: Validation of Cleaning Processes（清洁验证监管思路与证据要求）。
  
• 文献：swab/rinse 回收研究与方法论（例如评价 swab/rinse 的论文与回收实践综述）。
  
• 行业讨论/综述：TOC 用于清洁验证的通用说明与实践（ISPE / 行业资料）。
  
  

Jonny--

这是AI回答的吗？
否则就是大神了

Lily_VIP

学习学习