求教关于细菌内毒素检查的几个问题

时间煮雨12

本人未曾做过细菌内毒素检测，赶鸭子上架的学习了一下药典和标准操作指南，大部分都是理论知识，对于实际操作还有些许疑问，问题比较多，还望能得到资深前辈们的指点，不胜感激！

1、实验环境的要求----药典和GMP中未规定内毒素检查的环境要求，在《药品GMP指南-质量控制实验室与物料系统》一书中有提到“为保证实验结果的准确性，防止污染，内毒素检查实验应在密闭的洁净室中或密闭实验室的超净工作台下进行。检测人员应经过严格的培训，并应配备相应的防护设施（如穿防护服，戴口罩、头套等）”（258页）。那么请问：
①目前大家的内毒素试验环境是怎样的？
②所谓“洁净室”是指有背景级别（C或D级？）的房间吗？
③如果采用超净工作台进行试验，在层流下使用鲎试剂和细菌内毒素工作标准品，不会容易吹起吗？

④用于孵育的水浴缸也需要放在超净工作台中吗？

2、内毒素试验结束后，含有鲎试剂和内毒素标准品的安瓿如何进行处理？直接丢弃？大量水冲洗？是不是会有环境安全隐患呀？

3、内毒素实验用玻璃器具的清洗：一般流程是洗洁精浸泡（是否有时间要求？）→自来水冲洗→纯化水冲洗3遍（还是注射用水？）→空干→锡箔纸包裹→放入金属容器中→250℃30分钟以上→恢复至室温后取出。
除了括号内的疑问外，包裹了锡箔纸处理的可以2周内使用，而直接放入金属容器烘烤的需要在2天内使用（这段话源于中国药品检验标准操作规程），你们实际操作是怎样的呀？

4、药典中指出，在干扰试验中，需要用“使用的供试品溶液应为未检出内毒素且不超过MVD的溶液”进行干扰试验，那么对于一个新品种的内毒素检测方法的开发和验证，再未经过干扰预实验和干扰试验的前提下，无法取得具体的稀释倍数和鲎试剂灵敏度等数据，如何能提供出内毒素检测阴性的供试品呢？

5、同样也是在干扰试验这一环节，药典2015年版给出的“用检查用水稀释的内毒素（C组）为4组，每组2个平行样”，而2010年版的标准操作规程是4组，每组4个平行样。是否依据最新的2015年版药典？先阶段你们都是怎么做的呢？

6、在新方法的建立过程中，需要采用2家不同厂家的鲎试剂进行验证，以确保检测方法的适用性。那么是否需要不同灵敏度的鲎试剂进行对比呢？我拟用λ=0.25EU的鲎试剂进行验证，那么是否还需要用λ=0.06EU的鲎试剂进行安全系数的验证呢？这一块我不是特别懂。

7、在建立内毒素检测方法的过程中，我采购的是厂家（安度斯）的内毒素工作标准品，请问是否需要采购内毒素国家标准品对其进行标定之类的？还是说可以直接使用？

8、在干扰预实验中（确定供试品的最小稀释倍数），实验结果的第一个阳性结果即为对应的倍数，但是我也在相应的培训PPT上看到说，一般会选择下一个倍数为干扰试验的稀释倍数（比如预实验显示第一个阳性结果为稀释40倍，那么是采用40倍还是80倍作为干扰试验的稀释倍数呢？），实际操作中，你们是怎么制定这个供试品的稀释倍数的呀？

岁寒三友

一般在超净工作台进行试验；锅炉处理；5，我觉得两个方法对比做一下  看看有没有差异

预知子

建议去看下相关指南

时间煮雨12

岁寒三友 发表于 2018-3-14 14:43
一般在超净工作台进行试验；锅炉处理；5，我觉得两个方法对比做一下  看看有没有差异

超净工作台会不会有层流容易将内毒素和鲎试剂粉末扬起来呀？

饭团休走

2.作为利器处理
3.内毒素检查用到什么可重复使用的玻璃器皿了吗？

时间煮雨12

饭团休走 发表于 2018-3-14 15:49
2.作为利器处理
3.内毒素检查用到什么可重复使用的玻璃器皿了吗？

比如稀释用的试管

饭团休走

时间煮雨12 发表于 2018-3-14 16:50
比如稀释用的试管

哦...  我们用的无热源安瓿

清风11

饭团休走 发表于 2018-3-14 15:49
2.作为利器处理
3.内毒素检查用到什么可重复使用的玻璃器皿了吗？

使用一次性无热源的

Xiely

直接跟厂家联系，要他们给予指导