案例：GMP中无菌附录微生物标准的探讨

蒲公英

某公司规程中规定：每批次生产周期内A级区的取样点每4小时摆放1次培养皿进行沉降菌监测，监测结果以多个培养皿的数值累积计算的平均值为标准，若单个培养皿有菌生长且平均结果＜1cfu/4h，视为超警戒限（不作为产品放行的依据），若单个培养皿＞3cfu/4h，则视为超行动限。

对于该标准制定的合理性，“蒲公英智库班”的同学展开了讨论。

蒲公英智库班：是一个微信社群，有着一定的准入门槛，每周末组织一次分享，每周不定期组织讨论，本文是根据同学们讨论的内容，由班委汇总整理，仅供参考。

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有同学提出疑问：假设某批次生产周期为24小时，那么某一A级取样点沉降菌连续监测6次，其间有2个取样点各长菌1cfu/4h，按照累积计数算平均值＜1cfu/4h，判定为合格，产品可放行。但长菌期间的风险可平均分摊到产品中吗？

还有同学提出：若某B级区微生物监测结果一皿9cfu，一皿0cfu，能单纯地计算平均值吗?

众所周知，2010年版GMP无菌附录和欧盟无菌生产附录，在微生物监测的标准下均有2个备注，明确指出标准中各值均是平均值，如下图：

仅仅从从文字上看两个附录标准上的注释，似乎该公司沉降菌监测结果以“平均值”作为产品放行的评判标准是合理的。

但有专家指出：USP 有个修订说明提到过关于高级别区域沉降菌、浮游菌监测结果评估原则。

首先，平均计算是肯定的。另外，需要明确准许每个碟子上最多有几个菌落（比如，最大就是1cfu ，超过1cfu就是偏差）。还有基于历史统计数据是稳定的，即：累计100次监测，99次都是未检出，偶尔出现一次检出（并且单碟不多于1cfu），则平均值不超过1cfu是可接受的。但是这种趋势不能连续，至少前99次未检出，本次检出还可以考虑接受。但是下一次就不能出现了，不然无法通过卡方检验。

对于B级区微生物监测结果一皿9cfu，一皿0cfu的情况，不能直接说“能不能平均”。一个完整且良好的质量保证体系，需要对监测微生物建立适合的，基于统计分析的判定原则。对于高级别（A/B），要设定适合的警戒限度。一个碟子 9cfu ，另一个0cfu，显然统计学显示“取样代表性”就存在不可接受的不良趋势。菌落外观，需要检察人员初步判断，是否是常见。如果未见过，则之必须触发质量趋势不良分析调查，进行微生物型别确定，在完成调查，确定原因和型别后，对比其他点位和人员体表微生物监测结果，综合评价，才能给出是否可以接受的结论。接受，包括了是否可以平均。

USP<1116>对洁净室、隔离器和RABS的微生物控制参数的描述里，提到了一个概念“回收率”，文中指出：由于微生物的取样方法的内在差异，污染回收率是一个在趋势结果方面比关注某个取样点的数值变化更有用的参数。

因为微生物生长的准确度和精密度与回试验的局限性，分析人员可以考虑检测到的频率，而不是某个样品中监测到的cfu数。这也不是简单的微生物直接计数，而是对可能由一簇微生物引入的污染监测。

应对确定每个洁净室环境的污染回收率，一个点和房间的污染回收率发生变化表明需要采取纠正措施，ISO5级的关键区域的空气携带或表面污染的回收率在现有的方法水平下应达到1%或更低。在已有的监测方法的基础上，封闭的RABS和隔离器的污染回收率应明显更低，并检测到小于1%。

同一采样周期内一个环境内多个点观测到污染表明产品的污染风险增加，并应谨慎地评估。多个点几乎同时出现污染也可能是来源于低劣的取样技术，因此在做出关于失控趋势的分析前应谨慎地回顾。

无菌衣的取样最好是在生产结束时进行，这些取样点的平均值应该小于1%。封闭的RABA和隔离器的手套应达到比污染回收率＜0.1%更严格的要求。

USP推荐的无菌环境初始污染回收率如下：

检出频率的制定应该根据实际的监控数据制定，并每月进行评估。行动限应根据实验操作能力制定。如果检出频率超过了表3的推荐值或超出了确定的生产能力，应实施纠正措施。

USP<1116>对微生物数据短暂的有效偏离也做出了相应说明：

由于独立的一个偏离几乎不可能指向一个确定的原因，只能考虑相关总体测试。当没有明确的科学数据时，要给出一个根本原因是不明智的。同时也要了解微生物分析的多样性。实际上，没有一个科学的原因能将25cfu和15cfu进行区别。在无菌生产工艺中，不应将15cfu作为一个有意义的数值，因为它实际上和14cfu没有什么区别。微生物检测人员应用他们的方式对偏离进行实际的科学判断。

从中可以得出结论：关键区域的微生物监测结果不能仅仅以“平均值”小于1cfu来作为产品放行的判定标准，应该基于历史数据做统计分析。规范给的是原则，企业还需要对可能的细节做树状图。

wsx

有深度的好文，解惑了很多人的困惑。就是A级区沉降菌监控，到底能否有菌，PIC/S也有一个答疑。

河西智叟

这个就很有点中国特色了，平均！提出这个问题的企业应该没有一个完善的追溯体系，不想因为个别时间段的不合格而放弃全部产品，也不敢因为均值的合格而放行全部产品，如果有了追溯体系，你就可以把不合格部分的产品从中剥离开，通过风评，对合格部分产品按实际再做判断，这样就不会纠结了。

静水蓝心

其实我想问的是：有多少企业的趋势分析是及时、有效且准确的？

syhorchid

谢谢分享

北重楼

这个需要有完整的微生物检测追溯体系

老道

微生物污染回收率到底怎么做啊？没找到相关资料

寒江行舟

我感觉这个还是需要很深厚的数学功底，特别是概率与统计工具

lirongzhang70

我看到群里有人在发这篇文章，忍不住上论坛来说一说自己的看法。
首先要搞明白什么情况下才能用平均值表示，只有对于均一的产品，为了使示值接近真实值，才会求平均值，就像我们经常做的含量等指标。对于非均一产品，用均值表示实际上是对真实值的极大偏离，举个例子，用9个穷光蛋与马云平均，得出有10个亿万富翁的结论，明显是错误的。再来看药典规定无菌检验的结果判定方法，是任何一管确证有菌就判定不合格，并没有采用平均的方法。回到本文描述的情况，是将不同监测时间段的数据用来平均，时间上已经存在不同一，这些时间段的空气并不是经过充分混合的同一段空气，无法判定均一，因此用平均值是不合适的。举个例子，用10个碟子进行监测沉降菌，9个在开启A级情况下测试，1个在关闭A级（开启B级的情况下）测试，结果都符合相应级别的标准，用平均值表示的话，是符合A级标准的，能说产品都是在A级下生产的吗。
另外，再来说一下检验中＜1的概念，应该看做是一个符号，代表的是“检验中未检出”，是为了体现检验只对样品负责，不对整个产品负责，不能当做数学上的数字来理解，在实际使用中采用的方式应该是不论小数点后多少位有数字都进位取整数表示为1，只有未检出才表示为“＜1”.

002小六子

好好学习，天天向上

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