宿主蛋白残留 稀释倍数 如何确定

hangzhouhdjy

我们产品的原液：总蛋白含量为9.6mg/ml，其宿主为毕赤酵母（pichia pastoris）。需要测定其宿主蛋白残留量，因涉及到稀释倍数不知如何确定，现在此向广大专业人士请教，期待您的回复，万分感谢！
我们使用的检测试剂盒是CYGNUS的pichia pastoris host cell proteins，该试剂盒标准宿主蛋白分别为0ng/ml、1ng/ml、4ng/ml、20ng/ml、75ng/ml、250ng/ml，用来制作标准曲线。通过Elisa方法测定宿主蛋白残留，用HRP-TMB显色系统。
问题如下：1、当总蛋白含量高到什么程度的情况下需要对样品进行稀释？2、稀释的话采用多大的稀释倍数比较合适？3、通过多种稀释倍数的摸索，检测后得到的宿主蛋白含量落在标准曲线的哪个浓度范围更好，数据更可信？
                     

十二月的雪

根据你们的产品工艺质量标准，确定，宿主蛋白的总量应不能超过多少，不然稀释后抗原的含量就会不符合要求。

window

宿主蛋白残留不超过总蛋白的0.1%，即最高宿主蛋白残留允许为9.6ug/ml,
按此计算，稀释100倍，为96ng/ml ,你的限值范围应在0-96ng/ml的曲线范围内，在标准曲线的范围内

hongwei2000

没做过
单纯从检验角度来说
你的供试液中所含宿主蛋白的浓度应在试剂盒最低和最高浓度之间
也就是将你的总浓度与限度相乘
如果低于最高浓度理论上可以不稀释
如果高于最高浓度则必须要稀释
稀释情况要考虑准确性的要求
一般杂质准确性要求要远低于主成分
例如主成分偏离一般是1%-2%
而杂质是5%-10%特别小的可以是20%
所以对于杂质检测稀释精度可以使用略差一些的准确性要求
例如含量测定一般使用移液管为5ml或10ml
容量瓶是50ml或100ml
而杂质检测可以使用1ml或2ml移液管
量瓶可以使用小到10ml的
一般稀释时最好使用的稀释次数少
能一次的不两次能两次的不三次
通常稀释倍数为5-100倍
作为一个检验方法业说
不宜去摸索方法参数
应有明确规定

window

与主题无关的，好奇问题
原液蛋白9.6，看来稳定性极好啊

herozxq

色谱微信群，加zorro_zheng，加时请提示制药

hangzhouhdjy

十二月的雪 发表于 2018-4-20 09:52
根据你们的产品工艺质量标准，确定，宿主蛋白的总量应不能超过多少，不然稀释后抗原的含量就会不符合要求。

我们初定标准为宿主蛋白含量为总蛋白含量的0.03%，完全不稀释的情况下检测出来为100-130ng/ml，向前辈们了解后主要担心的是总蛋白含量过高对宿主蛋白含量检测有很大的干扰，具体干扰程度我们也说不出个所以然，因此想咨询咨询。

hangzhouhdjy

window 发表于 2018-4-20 10:00
宿主蛋白残留不超过总蛋白的0.1%，即最高宿主蛋白残留允许为9.6ug/ml,
按此计算，稀释100倍，为96ng/ml , ...

我们初定标准为0.03%

hangzhouhdjy

hongwei2000 发表于 2018-4-20 10:06
没做过
单纯从检验角度来说
你的供试液中所含宿主蛋白的浓度应在试剂盒最低和最高浓度之间

我们初定标准为0.03%，即2.88μg/ml。但是我尝试在未稀释的情况下直接检测，得到的结果在100-130ng/ml之间。仅从数据上看结果是落在了标准曲线内75ng/ml--250ng/ml这个区间段，似乎又不需要进行稀释。稀释后落在的标准曲线内别的范围的区间段内，随着稀释倍数的增大，最终回无限接近于0ng/ml。我认为落到20ng/ml--75ng/ml这个标准曲线内的区间段是不是意味着结果的可信度更高，毕竟此区间段正好是这个标准曲线的中间部分，过低容易出现假阴性而过高又出现加阳性。方便再指导一下我不，谢谢！

window

hangzhouhdjy 发表于 2018-4-20 14:49
我们初定标准为0.03%，即2.88μg/ml。但是我尝试在未稀释的情况下直接检测，得到的结果在100-130ng/ml之 ...

确实是的。但要注意，这仅是一个限度检测方法。非含量检测
且该方法本需要进行验证，确认你的检测限。首先保证你的质量标准是在检测限以上，样品的稀释度的控制是使得样品浓度且在线性范围内（当然最佳是在线性中点）。如果按规定的限度标准，样品稀释后得到的检测值小于你的检测限。无疑该项目是合格的。此时的检测报告出具的是小于检测限（这个检测限是你验证的具体结果）

window

限度检测方法与含量检测方法在要求上有所不同的

刘东12

个人意见：首先需要对检测方法做方法学验证，干扰实验，稀释后的OD值最好落在标曲的中间值，因为标曲的中间值最灵敏且一般情况重复性都是最好的；选择落在中间值的稀释倍数做干扰实验，没有干扰才可以定稀释倍数，如有干扰需继续稀释，直至没有干扰，且不能超出试剂盒的检测下限，或者其他办法去除干扰。个人意见，仅供参考。

小金库

谢谢分享