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[生物制剂] 菌种的保存

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药徒
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楼主
发表于 2019-9-11 10:56:00 | 只看该作者 回帖奖励 |倒序浏览 |阅读模式
保存时间也不单是方法决定的,保存时各种条件都有影响。要综合自身条件技术考虑,目前我们自己用的冻干保存。
真空冷冻干燥保藏法
1准备安培管 用于真空冷冻菌种保藏的安培管宜采用中性玻璃制造,形状可用长颈球形底的,亦称泪滴型安培管。大小要求外径6~7.5mm,长105 mm,球部直径9~11 mm,壁厚0.6~1.2 mm,也可用没有球部的管状安培管。塞好棉塞,在压力0.11MPa,温度121℃条件下灭菌30min后备用。
2准备菌种 用真空冷冻干燥法保藏的菌种保藏期可长达几年甚至几十年,为了不出现差错,所用菌种纯度要高,而且菌龄要适宜。细菌和酵母菌的菌龄要求超过对数生长期,若用对数生长期的菌种进行保藏,其存活期反而降低。一般细菌的菌龄要求24~48h;酵母菌为3d;形成孢子的微生物则宜保藏孢子;放线菌和丝状真菌菌龄为7~10d。
3制备菌悬液与分装 以细菌斜面为例,用脱脂牛乳2mL左右加入试管中,制成浓菌液,每支安培管分装0.2mL。
4冷冻 冷冻干燥器有成套的装置出售,但价格昂贵。此处介绍的是简易的方法与装置,可达到同样的目的。
将分装好的安培管放低温冰箱 中冻结,无低温冰箱 可用冷冻剂如干冰(固体CO2)酒精液或干冰丙酮液,温度可达-70℃。将安培管插入冷冻剂,只需冷冻几分钟,即可使悬液结冰。
5真空干燥 为在真空干燥时使样品保持冻结状态,需准备冷冻槽,槽内放碎冰和食盐,混合均匀,可冷至-15℃。安培瓶冷冻槽的干燥瓶内。
6抽气 一般若在30min内能达到93.3Pa(0.7mmHg)真空度时,则干燥物不致溶化,以后继续抽气,几小时内,肉眼可观察到被干燥物以趋干燥,一般抽到真空度26.7Pa(0.2mmHg),保持压力6~7h即可。
7封口 抽真空干燥后,取出安培瓶,接在封口用的玻璃管上,可用L形五通管继续抽气,约10min即可达到26.7Pa(0.2mmHg)。于真空状态下,以煤气喷灯的细火焰在安培管颈中央进行封口。封口以后,保存于冰箱或室温暗处。
此法为菌种保藏方法中最有效的方法之一,对一般生活力强的微生物及其孢子都适用,即使对一些很难保存的致病菌,如脑膜炎球与淋病球菌等亦能保存。此法适用于菌种的长期保存,一般可保存数年至几十年。缺点是设备和操作都比较复杂。
液氮超低温保藏法
液氮保藏法是目前保存微生物菌种最可靠的方法,多数国家级菌种保藏单位都采用此法。
1准备安培管 用于液氮保藏的安培管,要求能耐受温度突然变化而不致破裂,因此,需要采用硼硅酸盐玻璃制造的安培管。安培管的大小通常使用75×10mm的安培瓶。
2加保护剂与灭菌 保存细菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的细胞时,则将空安培管塞上棉塞,在压力0.11MPa,温度121℃条件下灭菌15min;若保存霉菌菌丝体则需在安培管内预先加入保护剂,如10%的甘油蒸馏 水溶液或10%二甲亚砜蒸馏水溶液,加入量以能浸没以后加入的菌种块为限,而后再进行高压灭菌。
3接入菌种 将菌种用10%的甘油蒸馏水溶液制成菌悬液,装入已灭菌的安培管;霉菌菌丝体则可用灭菌打孔器,从平板内切取菌落圆块,放入含有保护剂的安培管内,然后用火焰熔封。浸入水中检查有无漏洞。
4冻结 再将已封口的安培管以每分钟下降1℃的慢速冻结至-30℃。若细胞急剧冷冻,则在细胞内会形成冰的结晶,因而降低存活率。
5保藏 经冻结至-30℃ 的安培管立即放入液氮冷冻保藏器的小圆筒内,然后再将小圆筒放入液氮保藏器内。液氮保藏器内的气相为-150℃,液态氮为-196℃。
6恢复培养 保藏的菌种需要用时,将安培管取出,立即放入38~40℃的水浴 中进行急剧解冻,直到全部融化为止。再打开安培管,将内容物移到适宜的培养基上培养。
此法除了适宜于一般微生物的保藏外,对于一些用冷冻干燥法都难以保藏的微生物如支原体、衣原体、氢细菌、难以形成孢子的霉菌、噬菌体及动物细胞都可长期保藏,而且不易发生变异。缺点是需要特殊设备。
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药生
沙发
发表于 2019-9-11 11:07:58 | 只看该作者
谢谢分享,非常实用。
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药徒
板凳
 楼主| 发表于 2019-9-11 13:30:12 | 只看该作者
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药徒
地板
发表于 2019-9-11 14:00:29 | 只看该作者
菌种保藏的意义在于尽可能保持其原有性状和活力的稳定,确保菌种不死亡、不变异、不被污染,保持菌株优良性状不退化,保持优良菌株存活,以达到便于研究、交换和使用等诸方面的需要。

点评

郝小琴  是的  详情 回复 发表于 2019-9-11 14:09
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药徒
5#
 楼主| 发表于 2019-9-11 14:09:44 | 只看该作者
syhorchid 发表于 2019-9-11 14:00
菌种保藏的意义在于尽可能保持其原有性状和活力的稳定,确保菌种不死亡、不变异、不被污染,保持菌株优良性 ...

是的
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