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[其他] 转载:方法学验证,“骗人”的回收率

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药徒
发表于 2019-12-3 13:07:05 | 显示全部楼层 |阅读模式
本帖最后由 山顶洞人 于 2019-12-3 13:43 编辑

在一个公众号内看到一篇文章,关于回收率,API和制剂出现了不一样的结果的可能性解释。曾经也确实遇到过类似的问题,也曾因为经验不足,烦恼了很久~今天碰巧看到有老师做出了总结,谢谢老师!
以下为转载文章:

经常有QC的朋友会遇到检验结果距离预期有较大差距的情况,或者批间差距(波动)比较大的情况,自己也搞不清楚是怎么回事,没准还挨老板(领导)训,“你怎么搞的”、“你做没做过回收率呀”、“回收率都没有问题,检验怎么就出问题了!”等等。有时固然是你检验的问题,有时可能是我准备在第十四章写的检验参数的问题,还有种可能就是回收率在“骗你”。

为什么说回收率会“骗你”,这是因为首先是你先“骗了”它,如果你“骗了”它,那么它偶尔“骗你”一两次也不过分吧。而一旦它“骗了”你,那你以后的检验数据可能就都是骗你和你的老板了。

大家都听说过质量源于设计的说法了,也有人听说过DOE(实验设计)的说法,可能有些人根本就没有意识到自己在“骗”回收率,得到到个“好”的结果就觉得万事大吉,殊不知如果你在设计上有缺陷,那你得到的结果可能就将会是一个“假阳性”。这一点包括CDE也不一定审得出来,曾经发现过ANDA方法验证回收率中有DOE缺陷,CDER也一样没发现,但这都不能说明什么,关键在于你的回收率是做给谁的,如果是做给你自己的,你觉得今后“受骗”的将是谁。
每次开头都说那么多,闲话少说。下面我将举几个例子来说说看,看看大家自己是不是在DOE上存在类似的情况。

1、制剂含量测定
1.1加样回收的必要性
很多人认为加样回收是中药用的东西,西药比较简单,没有必要做加样回收,直接回收就好了;还有人认为,我们API溶解性好,没有必要做加样回收,做起来还特别麻烦。

但制剂技术就是这么牛,它可以把难溶性API变得相对好溶解,也可以把易溶的API搞得溶解性变差,如果你考虑不到这一点,你就把API和辅料直接投到容量瓶里,甚至把API先溶解了再加到容量瓶里,测得的回收率当然就没有问题,但你怎么保证你的片子在测定时也像你的API那么好溶。

我曾经遇到过一个产品,API在水中是易溶的,在醇中也有很好的溶解性,但检测发现溶出度比含量(采用含量均匀度平均值,相当于投片法)高很多,有的批次甚至高10%以上,而且都是HPLC检测的、色谱条件也是一样的。进一步调查发现,该产品含量/稳定性含量波动非常大,而溶出度却相对比较稳定性,尤其是稳定性,有时含量已经“下降了”差不多10%,而溶出度却没有任何变化。你说我该相信哪个?有人说当然要相信含量了,溶出度是个半定量的方法。但此时和更多的时候,我选择了相信溶出度的结果:因为溶出度也是稳定性指示的方法,在样品能够全部溶解的情况下,影响溶出度准确度和精度的主要就是量筒,它的误差要大于量瓶,但影响不会超过2%;而溶出度原液的浓度一般要远远低于含量测定的贮备液的浓度,也就是说其相对浓度会低于含量测定贮备液,即可能有更好的溶解性。因此我做了一个简单的试验:取几批样品在不同时间进行对比试验,分别按正常方法制备供试品溶液(先制贮备液再稀释)和直接加大溶剂体积直接配制成供试液的浓度,分别测定含量,再与溶出度结果进行比较。结果显示,按标准进行的含量测定结果批间差异比较大,但基本上都低于溶出度;而直接稀释法测定的含量结果与溶出度测定结果出奇的一致,且波动性较小。
这就说明了一个道理,制剂在含量测定样品贮备溶液制备中浓度相对较高(其实绝对并不高,80μg/ml,且溶剂中易溶),其中的主成分不能被全部溶解释放出来;而此时如果是API加辅料的话则可能很容易溶解释放出来,这一点对于含有大量黏合剂的缓释制剂中尤其可能,而对于一些特殊剂型例如包埋类的产品,则可能性更是存在。这样如果你采用直接加入法测定的回收率看起来可能非常不错,但是它是在骗你的。所以此时就显示出的结果可能就是回收率很好,但产品的质量比预期要低,而且波动性可能还很大。

这时就显示出加样回收率的优势了:例如一个产品理论含量为100%,测得的含量为90%,那么意味着回收率为90%,而你采用API加辅料测定回收率时回收率为100%,而如果你采用的是一半制剂一半API加辅料的加样回收的方法的理论回收率为(90%+100%)/2=95%,如果上下各有1%的误差的话,前者回收率的范围是99%~101%,后者的范围是94%~96%,那么即使你回收率的可接受标准是每个样品均在97.0%~103.0%,你也会发现其不符合要求,检验方法有问题。

1.2研磨吸附的影响
其实我遇到过更多的情况是这样的,很多品种的含量均匀度平均值与溶出度的结果是一致的,波动性也很小;而含量测定的结果却明显低于上述两项,而且往往色谱条件也是一致的。与上面的结论是一样的,最终的调查结果是含量测定的结果有问题,含量均匀度与溶出度的检验结果更可信。这在小规格制剂品种是非常常见的。有一次我在给一家企业的研发部门讲检验技术方面的课时,甚至遇到了中间体含量千奇百怪的数据,从80%多到100%,什么样的数都有,制剂人员根本就不敢压片,我就告诉他们,你们直接按照理论片重压就好了(直接压片工艺),不用管检验数据,结果无论是含量还是含量均匀度都与预期是一致的。

QC相对于制剂中间产品的检验来说,更重要的是一种确认;如果你用QC的检验结果作为指导制剂生产(例如折算片重),往往可能会造成灾难性的后果。不管QC人爱不爱听,之前我也不爱听过,但这也是我血的教训得出的结论。事实上也是,发现OOS后调查的结果,原因是由于检验造成的可能不低于80%,剩下可能在10%是取样的问题,不到10%才是生产的问题。当然我会推文中去解释这是为什么、以及怎么去解决。
看到本节的小标题,大家可能也猜到了原因,就是吸附!

我们国内受药典影响,很多研发人员在检验方法开发时都习惯于采用研磨的方法,而有很多产品,尤其是小规格产品,在研磨的过程中主成分易被研磨工具所吸附,进而造成你称取那部分的样品主成分的含量相对较低,致使最终产品的检测结果偏低,而一旦这样的结果用于指导压片/填充,可能你的含量均匀度或溶出度的结果就不一定高成什么样子了。当然由于吸附的不可控性,你的含量结果也有可能有很大波动,或者接近于预期值或者远离预期值。

在这种情况下,为什么回收率是怎么“骗”我们的呢?道理很简单,你的API是直接加入到容量瓶里去的,这个过程是没有研磨工具去吸附你的API的,所以你可能得到很好的数据!换句话说,你的检测是有研磨过程,而你的回收率验证是没有这个过程的,也就是说,你的验证与你的方法是不一致的!你回收率验证的操作应该是,分别取相当于20片量的API和辅料,置研钵中,研细(时间、力度应与检验一致),再称取规定重量的样品,去配制溶液,再去检测回收率。

还有一点需要说明的是,做回收率不同样品应分别研制,而不要从一个研磨中称取,以避免恰好该研磨过程吸附极少而带来的“假阳性”数据。必要时应考虑不同人员之间的差异。

2、有关物质检验
其实本部分内容在本论坛中已经有过阐述,还是那个要求,你的验证应与你检验方法一致。例如对于特定杂质,你的检验方法是校正因子的方法,而你在回收率验证时采用的是外标法计算回收率,此时的数据就是一个伪数据,因为你杂质的计算方法是不同的,在回收率计算时没有采用校正因子。这也是我当时发现ANDA方法验证中存在的缺陷,但“所幸”的是CDER没有发现。

3、微生物限度检验
3.1纯化水中的微生物
很多人在论坛中问,纯化水微生物限度检验要进行方法学验证吗。

其实道理很简单,你首先要清楚微生物检验方法验证验证的是什么,不外就是通过回收率来确认你的样品本身对菌是否有抑制作用,如果有的话方法就不适用,如果没有的话方法就适用。

那么水本身没有抑菌性是公认的,你还需要验证吗?

其次,如果水本身有抑菌性的话,那你的培养基中含有95%以上的水,也就是说你一个培养皿里15ml培养基其中有约13ml的水,而你纯化水检验时采用的薄膜过滤法所残留的水也就0.1ml,你13ml的水都不去关心,你却去关心那0.1ml的水?两个皿之间培养基水的量之间差得也不止0.1ml吧!

第三,也就是最关键的一个。你如果要做回收率验证,那么你采用什么菌种,还是药典中那五种吗?例如中国药典现行版检测的培养基是富营养的营养琼脂培养基,这五种菌在该培养基中均适于生长,你用这五种菌测得的回收率数据当然会非常漂亮,除非你的DOE有问题,但它能代表实际吗?简单的一个实验就会得出结论,用一组纯化水,分别采用营养琼脂和R2A培养基进行检测,可能最终的结果是,用营养琼脂培养基检测的结果几乎都是<1CFU/ml,而用R2A培养基检测的结果可能甚至达到几十CFU/ml!那么此时你的回收率呢,是不是在“骗你”!与其进行回收率试验,不如进行培养基筛选。由于水的来源不同,有些菌适合于低营养下成长,而有些适于富营养下成长。由于水本身营养成分比较低,除非是受污染的水作为原水,所以一般更适用于在低营养培养基下成长,相信这也就是为什么中国药典计划修改纯化水检测用培养基的原因。

3.2表面微生物
那么设备表面的微生物的检验方法需要进行验证吗?

实际上道理都是一样的。可能我们更关心取样方法本身带来的影响,但实际上这种影响相对于微生物的检验误差是几乎可以忽略的,要知道微生物检验方法甚至在回收率50%~200%都是可以接受的(见USP)。

还有一个重要的原因,就是你设备表面微生物(例如清洁验证)是要求在设备干燥条件下进行的,而如果你去进行验证,那在你涂到设备表面上到表面完全干燥,这个过程可能有些菌已经死去了,这就可能造成验证结果的“假阴性”。

总之,要想你的回收率试验结果不“骗”你,你就要设计好你的检验方法和验证操作,并确保二者在操作方法上是一致的。

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药徒
发表于 2019-12-3 13:51:59 | 显示全部楼层
前排,另外“还有一个重要的原因,就是你设备表面微生物(例如清洁验证)是要求在设备干燥条件下进行的,而如果你去进行验证,那在你涂到设备表面上到表面完全干燥,这个过程可能有些菌已经死去了,这就可能造成验证结果的假阴性”这里是指设备表面干燥的过程会有部分菌死去妈,那么是不是意味着我清洁过程的“干燥”这个步骤是降低微生物限度的重要步骤

点评

山顶洞人  本来就是啊,设备清洁完后,保存两要素,干燥、遮盖  详情 回复 发表于 2019-12-3 21:32
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药士
发表于 2019-12-3 21:32:28 | 显示全部楼层
紫宵 发表于 2019-12-3 13:51
前排,另外“还有一个重要的原因,就是你设备表面微生物(例如清洁验证)是要求在设备干燥条件下进行的,而 ...

本来就是啊,设备清洁完后,保存两要素,干燥、遮盖
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药士
发表于 2019-12-3 13:42:39 | 显示全部楼层
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药徒
 楼主| 发表于 2019-12-3 14:03:02 | 显示全部楼层
紫宵 发表于 2019-12-3 13:51
前排,另外“还有一个重要的原因,就是你设备表面微生物(例如清洁验证)是要求在设备干燥条件下进行的,而 ...

恩恩~~谢谢老师指点~~是呢,有时候找问题的时候,也许就是这些被默认的操作,感觉没有问题的操作,恰恰就是漏掉的关键~
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发表于 2019-12-3 14:14:39 | 显示全部楼层
谢谢,太实用了
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药徒
发表于 2019-12-3 16:49:13 | 显示全部楼层
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发表于 2019-12-3 16:58:39 | 显示全部楼层
去年请了国内一个很权威的药品检测专家给做培训,专门问了回收率怎么计算的问题,回复是不管什么方法(自身对照、面积归一),都采用外标法计算。以前公司经理说,国外的观点,回收率就只是考察回收率,采用校正因子或者其它的计算,就引入别的误差了。对这个,现在也很迷惑,只能做的时候不同方法都算一下了。
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药徒
发表于 2019-12-3 17:31:06 | 显示全部楼层
谢谢分享,受教了。
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发表于 2019-12-4 08:39:32 | 显示全部楼层
谢谢分享,学习了
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药生
发表于 2019-12-4 09:16:22 | 显示全部楼层
学习了,谢谢提供分享。
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药徒
 楼主| 发表于 2019-12-4 10:01:14 | 显示全部楼层
hnwxw 发表于 2019-12-3 14:14
谢谢,太实用了

共同学习~~~
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药徒
 楼主| 发表于 2019-12-4 10:01:59 | 显示全部楼层
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药徒
 楼主| 发表于 2019-12-4 10:02:40 | 显示全部楼层
黑咖啡1 发表于 2019-12-4 08:39
谢谢分享,学习了

共同进步~~
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发表于 2019-12-4 11:19:36 | 显示全部楼层
谢谢分享,受教了,之前我做的一个样品就是经过研磨后被吸附了,后来换成了玛瑙研钵
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发表于 2019-12-4 11:41:14 | 显示全部楼层
谢谢分享,微生物的回收率挺麻烦的
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药生
发表于 2019-12-4 12:38:56 | 显示全部楼层
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药徒
 楼主| 发表于 2019-12-4 13:10:01 | 显示全部楼层
原酒言 发表于 2019-12-4 11:19
谢谢分享,受教了,之前我做的一个样品就是经过研磨后被吸附了,后来换成了玛瑙研钵

嗯呢~~这些真的是只有自身遇到了,感触会比较深~~当初找原因的时候,我太难了,困惑了好久~
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发表于 2019-12-4 13:52:02 | 显示全部楼层
那么有做过微生物擦拭回收率的吗
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药徒
发表于 2019-12-4 14:58:08 | 显示全部楼层
学习了,原来背后还有这么多知识
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