白头翁含量

胡瑞红

哪位老师做过白头翁含量，用药典方法做不出来，哪位做过，

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仪器设备  Waters高效液相色谱仪(515 HPLC Pump,Waters 2478 Dual λ紫外检测器, 威马龙色谱数据工作站)；

　  色谱条件  色谱柱：Inertsil ODS-3C18 ( 5μm, 250×4.6mm)；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液(29:71) ；流速：0.8mL·min-1；检测波长：203nm；进样量：对照品、供试品分别进样10μL、20uL；柱温：常温。
试样制备：

对照品溶液制备  取白头翁皂苷B4对照品6mg，精密称定，加流动相溶解成每1mL含白头翁皂苷B4对照品0.6mg的溶液，即得。

　  供试品溶液的制备  精密称取白头翁药材粉末(过3号筛) 0.2g，加甲醇10mL，密塞，超声处理30分钟(功率150W频率40KHz)，放冷，滤过，取滤液1mL置蒸发皿中水浴挥干，放冷，加流动相转移至10mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。
操作步骤：
  精密吸取对照品溶液和供试品溶液，进样，测定，外标法计算含量。

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按照药典方法，对照品可以出峰吗。

★云翼☆

问题不够详细，提供的信息太少

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【摘要】  目的建立白头翁药材中白头翁皂苷B4的含量测定方法。方法采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法，色谱柱：Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈-0.1%磷酸（28∶72）为流动相，流速：1.0 ml·min-1，检测波长：205 nm，柱温：30℃。结果白头翁皂苷B4在29.4～147 mg·L-1内呈良好线性关系，相关系数为0.999 9，平均回收率为99.7%，RSD为1.14%。结论该方法简便、准确、重复性好，可用于白头翁药材的质量控制。

【关键词】  反相高效液相色谱法； 白头翁； 白头翁皂苷B4

白头翁为毛茛科植物白头翁Pulsatilla chinensis（Bge.）Regel的干燥根，味苦，性寒，归胃、大肠经。白头翁始载于《本经》，具有清热解毒，凉血止痢之功效，可用于治疗热毒血痢，阴痒带下，瘰疬，痈肿，秃疮等［1］。其主要有效成分为皂苷类成分，白头翁皂苷B4为其主要有效成分之一，其含量也较高。故本实验采用反相高效液相色谱法对其含量进行测定，对白头翁药材或制剂的质量标准研究具有重要意义。实验结果表明，该方法简便可靠，重现性好，为白头翁药材或制剂的质量控制提供了参考依据。

　　1  仪器与试剂
   
　　美国Waters高效液相色谱仪（515泵，2487紫外检测器，ChromStation色谱工作站），KQ3200型超声仪（昆山市超声仪器有限公司）。
   
　　白头翁皂苷B4对照品（中国药品生物制品检定所），白头翁药材由三九药业提供，甲醇为色谱纯（天津市康科德科技有限公司），水为自制重蒸水。

　　2  方法与结果

　　2.1   色谱条件色谱柱为Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈-0.1%磷酸（28∶72）为流动相，流速为1.0 ml·min-1，检测波长为205 nm，柱温为30℃，进样量：10 μl。

　　2.2  溶液的制备

　　2.2.1  对照品储备液的制备精密称取白头翁皂苷B4对照品1.47 mg，加甲醇定容至10 ml，制成每1 ml含白头翁皂苷B4 147μg的溶液，作为对照品溶液。

　　2.2.2  供试品溶液的制备白头翁药材粉碎后，精密称取药材粉末（过3号筛）0.12 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10 ml，超声30 min，放冷，过滤，滤液置 50 ml量瓶中，用少量流动相洗涤容器及残渣，洗液并入同一量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，过0.2 μm滤膜即得。

　　2.3  系统适用性试验取供试品溶液，在上述色谱条件下进样分析，白头翁皂苷B4与相邻色谱峰的分离度大于1.5，理论塔板数不低于3 000（图1～2）。

　　2.4  线性关系考察取对照品储备液，按照不同比例稀释，使白头翁皂苷B4质量浓度分别为29.4，58.8，88.2，117.6，147 mg·L-1。分别取上述溶液各10 μl进样测定，记录色谱图。以对照品质量浓度X为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线并进行回归计算，回归方程为：Y = 2.8844X - 2.04 (r=0.999 9，n=5)。结果表明，白头翁皂苷B4质量浓度在29.4～147mg·L-1内呈良好线性关系。结果见表1。表1  标准曲线结果（略）

　　2.5 仪器精密度实验取同一对照品溶液，按上述色谱条件，重复进样5次，计算白头翁皂苷B4色谱峰面积的RSD为0.32%（n=5）。结果见表2。表2  精密度结果（略）

　　2.6  方法重复性实验取同一批号的样品，按“2.2.2”条方法平行制备5份样品按上述色谱条件进样分析，计算白头翁皂苷B4含量的RSD为1.37%（n=5）。见表3。表3  重复性结果（略）

　　2.7  稳定性实验取同一供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，12h注入液相色谱仪，依法测定。计算白头翁皂苷B4色谱峰面积的RSD为1.47%（n=6）。结果见表4。结果表明，样品溶液在12 h内稳定。表4  稳定性实验结果（略）

　　2.8  回收率实验精密称取已知含量的白头翁药材粉末（过3号筛）6份，分别精密加入高、中、低质量浓度的对照品（相当于药材含量的80%，100%，120%，每一质量浓度2份），按上述方法测定分析，白头翁皂苷B4平均回收率分别为99.7%（n=6）（结果见表5）。表5  回收率实验结果（略）

　　2.9  含量测定取3批供试品，按“2.2.2”条操作，在上述条件下进样分析，记录色谱峰面积，采用外标一点法计算白头翁皂苷B4的质量分数为4.9%。

　　3  讨论

　　3.1  色谱条件的选择检测波长的选择参照《中华人民共和国药典》2005版（增订）［2］部分的白头翁项下，药典选择测定波长为201 nm，流动相选用甲醇和水，我们进行了样品的全波长扫描，发现在200～205 nm波长范围内，样品均呈现较强吸收，以甲醇和水为流动相基线极不平稳，参考相关文献［3，4］，HPLC法测定白头翁含量所用的流动相是比例不同的甲醇-0.1%磷酸系统和乙腈-0.1%磷酸等系统。本文经过多次实验摸索，发现由乙腈-0.1%磷酸系统在205 nm波长下基线平稳，分别选用不同比例的该流动相系统：乙腈-0.1%磷酸（30∶70）；乙腈-0.1%磷酸（29∶71）；乙腈-0.1%磷酸（25∶75），发现乙腈-0.1%磷酸比例为28∶72能够使白头翁皂苷B4得到较好分离，且重复性好。

　　3.2  样品提取条件的选择实验过程中，我们分别采用回流和超声两种方法进行提取，超声提取效果明显好于回流提取法；分别采用甲醇，70%乙醇，95%乙醇作溶剂进行提取，结果显示甲醇提取效果更好。
   
　　该实验为白头翁药材中白头翁皂苷B4的检测及含量测定提供了参考方法，为白头翁药材的质量控制规范化和标准化提供了依据。