宿主蛋白残留 线性范围

hangzhouhdjy

大家好，请教一下有关宿主蛋白残留检测的问题，请多多指教，谢谢！

供试品为E.coli表达系统制造出来的，属于重组蛋白类生物制品；我采用的是CYGNUS的E.coli HCP检测试剂盒，根据ELISA的方法进行检测。


今天在和同行进行技术探讨时，对方提到了供试品的宿主蛋白残留量应落在检测试剂盒的线性范围里，否则试剂盒不适用。



举例：供试品蛋白浓度3.1mg/ml，内控的合格标准为宿主蛋白残留量<0.01%，即<310ng/ml。其中检测试剂盒的宿主蛋白标准品为0、1、3、12、40、100ng/ml，以这6个点作标曲来换算出供试品中的宿主蛋白残留量。我将供试品稀释至1mg/ml再上机检测，根据供试品的检测值1.81ng/ml乘以相应的稀释倍数3.1得出宿主蛋白残留量是5.61ng/ml。加标量选择3ng/ml这个标准品，加标回收率在80~120%的范围里。


意见：同行说，根据宿主蛋白残留量的合格标准来看，试剂盒的线性范围是0~100ng/ml，并未包含了310ng/ml，因此CYGNUS的试剂盒不适用，要更换线性范围更广的试剂盒。  此外，还提到加标回收的事情。根据直接检测供试品的宿主蛋白残留量，再加入宿主蛋白标准品，得到加标质控品。此时的加标质控品的宿主蛋白含量应达到宿主蛋白残留量的合格标准。即供试品1.81+标准品308.19=加标质控310


疑惑：①尽管制订内控的合格标准比较低，但是实际检测得到的供试品宿主蛋白残留量，远远小于合格标准，为何说试剂盒不适用？②合格标准的310ng/ml，只是内控的最低可接受值，为何不是应确保检测值落在试剂盒的线性范围内，而是关注内控最大值？③一般情况下，供试品的宿主蛋白残留量是1~100ng/mg，即占供试品蛋白含量的0.0001~0.01%，如果供试品的蛋白浓度很高，岂不是对试剂盒的线性范围要求更高，恐怕市面上都买不到了？④通过稀释的办法降低供试品的蛋白浓度，在内控的合格标准不变的情况下，检测值一定落在试剂盒的线性范围里。是不是又会存在这样的情况：本身供试品的宿主蛋白残留量很低，人为地稀释过度后导致无法检测，从而造成了假阴性的结果？
         

每文

1.按照你假设的浓度3.1mg/ml的样品,试剂盒线性范围是0-100ng/ml，确实是没有包含内控的合格标准为宿主蛋白残留量<0.01%，即<310ng/ml，但为什么要包含呢，而且检测宿主蛋白残留一般都是在中控阶段和三批放行检测下，而且楼主刚刚举例这个样品浓度比较低，有些项目的中控阶段样品宿主残留会很高很高，如果按照你认识的那位同行所说，目前市场没有相应的试剂盒满足同行所要求的，再者说没必要，因为这个内控标准是根据检测值乘以稀释倍数来确定的（只要检测值在试剂盒线性范围内就可以了，但是你以后检测样品是，最好能做几个不同的稀释倍数，如原液.10.20.40.80倍，就算宿主蛋白残留很低，也能检测出来），而且目前美国药典对于宿主蛋白残留量也是要求＜100ppm，楼主这个可以的，同行建议不可取。
2.加标质控一般不都是看加标回收率嘛，例如分别检测A和B,A=标准品A+样品    B=样品   ,加标回收率=A-B/理论值A*100%。

蒲公英CK

关于线性范围问题，赞同楼上的观点。再举一个例子：检测蛋白含量时，Lowry法的线性范围为20-250 μg/mL，难道10mg/mL的样品就不能用该法检测了吗？很显然，只要稀释一定倍数，使实际检测供试品浓度在其线性范围内即可。

hangzhouhdjy

每文 发表于 2021-3-16 22:06
1.按照你假设的浓度3.1mg/ml的样品,试剂盒线性范围是0-100ng/ml，确实是没有包含内控的合格标准为宿主蛋白 ...

是的，我认为检测值落在试剂盒的线性范围内就可以。

顺便再请教一下，供试品蛋白浓度为3.1mg/ml，内控的合格标准为宿主蛋白残留量<0.01%，即<310ng/ml。我将供试品稀释至1mg/ml再上机检测，在内控不变的前提下，宿主蛋白残留量<0.01%，即<100ng/ml。此时正好落在试剂盒的线性范围内(0~100ng/ml)。

假设我将供试品稀释至2mg/ml再上机检测，在内控不变的前提下，宿主蛋白残留量<0.01%，即<200ng/ml。此时就不落在试剂盒的线性范围内(0~100ng/ml)。这种情况下是不是就不合理了？
实际检测时，是否一定要根据内控的合格标准和供试品的浓度，换算出宿主蛋白的残留量，来确定供试品的稀释倍数，使得供试品在上机检测时落在试剂盒的线性范围内。

举例：3.1mg/ml的0.01%是310ng/ml，稀释到1mg/ml后，0.01%是100ng/ml。要是稀释到2mg/ml后，0.01%是200ng/ml。稀释到2mg/ml上样就不合理？

hangzhouhdjy

蒲公英CK 发表于 2021-3-17 09:10
关于线性范围问题，赞同楼上的观点。再举一个例子：检测蛋白含量时，Lowry法的线性范围为20-250 μg/mL，难 ...

是的，实际检测值落在线性范围内才是最合理的。

顺便请教一下：用lowry法检测蛋白含量时，是否一定要根据内控的合格标准和供试品的浓度，换算出蛋白浓度，来确定供试品的稀释倍数，使得供试品在上机检测时落在线性范围内。

每文

hangzhouhdjy 发表于 2021-3-17 14:41
是的，我认为检测值落在试剂盒的线性范围内就可以。

顺便再请教一下，供试品蛋白浓度为3.1mg/ml，内控 ...

其实不管稀释到多少  只要检测值落在试剂盒线性范围里就可以了

每文

每文 发表于 2021-3-18 09:05
其实不管稀释到多少  只要检测值落在试剂盒线性范围里就可以了

  其实在项目初期样品送检时  你可以按照内控标准和供试品浓度进行了换算  确定了稀释倍数  但有可能检测结果也不再线性区间  当然这种情况比较少见  但是我碰到过  建议你对于你们类似的工艺阶段的样品稀释（就是当时检测出报告的值是稀释了多少倍）做个汇总  以后碰到其他项目的就照猫画虎  基本上在线性范围里

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