EK酶(肠激酶) 宿主蛋白残留

hangzhouhdjy

大家好，请教一下：

最近需要检测自家公司生产的EK酶(肠激酶)的宿主蛋白残留，它属于蛋白酶的一种，它的宿主是毕赤酵母。车间送来的样品里含有甘油，是为了长期保存而添加的。据了解，商品化的EK酶(肠激酶)并没有添加甘油。

使用的是CYGNUS的Pichia Pastoris HCP Kit(货号F140)，该试剂盒的6个标准品为0、1、4、20、75、250ng/ml；样品稀释液是CYGNUS的Sample Diluent Buffer(货号I028)

过程如下：样品的浓度为2.5mg/ml，我稀释到0.5mg/ml进行检测，同时还做了加标回收的考察(样品0.5mg/ml+标准品10ng/ml)，检测的结果只有16%的回收率。(初步规定可接受的回收率为70~130%)。

遇到回收率太低的这种情况，是否因为这些原因：①样品中甘油的存在，干扰了标准品的回收；②样品本身属于蛋白酶，会降解了一部分标准品？③两者都有？

我后期继续研究的话，想从这两方面进行尝试，请大家帮忙指导一下，看是否合理，感谢您！！！

一、维持样品的上样浓度不变(0.5mg/ml)，在加标回收的考察时，添加更高浓度的标准品(50ng/ml)，即样品0.5mg/ml+标准品50ng/ml。

理由是：保持样品浓度不变，则它对于标准品回收的干扰也不变。从前一次回收率只有16%的情况来看，添加了10ng/ml，回收到1.6ng/ml，损失掉(10-1.6=8.4)ng/ml。假设损失不变时，当添加了50ng/ml，回收到(50-8.4=41.6)ng/ml，则回收率为41.6/50=83.2%，就能符合规定。

二、维持添加标准品的浓度不变(10ng/ml)，进一步对样品进行稀释，降低其上样的浓度(假设为0.05mg/ml)，即样品0.05mg/ml+标准品10ng/ml。或者继续将样品稀释至比0.05mg/ml更低再添加同样的标准品。

理由是：样品的上样浓度降低，理论上它对于标准品回收的干扰也随之降低。随着对样品的不断稀释，干扰因素总是能够降低至不影响标准品的回收。

张寅

如果觉得甘油有干扰，是不是可以做个空白对照？就是配置一份不含产品，其他辅料都一样的样品。或者至少配一份一样浓度的甘油的样品来做空白对照？

另外，标准品应该就是毕赤酵母吧，就是你们产品的宿主，你确定你们产品会降解他自己的宿主吗？

碎灬訫

查查CYGNUS的Pichia Pastoris HCP Kit试剂盒说明书定量限，也有可能10ng/ml已经低于定量限了

清晨的太阳

我进来瞧瞧

hangzhouhdjy

张寅 发表于 2021-7-23 09:36
如果觉得甘油有干扰，是不是可以做个空白对照？就是配置一份不含产品，其他辅料都一样的样品。或者至少配一 ...

谢谢您。已确定了不是甘油的干扰，初步判断就是样品本身是蛋白酶造成的干扰。
标准品是毕赤酵母的宿主蛋白，不是毕赤酵母。
宿主会大量表达目标蛋白，且宿主本身的蛋白质也会表达，因此重组蛋白质产品才会受到宿主蛋白的污染。
宿主蛋白包括，宿主自身的结构蛋白和宿主分泌出的促生长因子。

hangzhouhdjy

碎灬訫 发表于 2021-7-24 19:32
查查CYGNUS的Pichia Pastoris HCP Kit试剂盒说明书定量限，也有可能10ng/ml已经低于定量限了

谢谢您！我根据您的提示，去CYGNUS的官网查找了Pichia Pastoris HCP Kit试剂盒说明书，说明书里面的Sensitivity(灵敏度)里提到，LOQ(定量限)为0.4ng/ml(标准模式下检测)、1.5ng/ml(快速模式下检测)。
我的加标浓度10ng/ml是超过LOQ的，理论上样品不干扰的话，应该能成功回收的。

张寅

hangzhouhdjy 发表于 2021-8-4 14:11
谢谢您。已确定了不是甘油的干扰，初步判断就是样品本身是蛋白酶造成的干扰。
标准品是毕赤酵母的宿主蛋 ...

那您现在怎么做验证？把样品稀释后做加标回收吗？

hangzhouhdjy

张寅 发表于 2021-8-5 16:19
那您现在怎么做验证？把样品稀释后做加标回收吗？

样品本身所含有的宿主蛋白残留就不多，持续稀释后由于仪器和试剂盒灵敏度的限制，容易造成假阴性。
因此，我在尝试消除或者抑制样品的酶活力，但又不破坏样品的宿主蛋白，这样做应该达到回收率合格。