基于化学蛋白质组学的靶点鉴定策略

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体外高通量筛选应用分子细胞水平的药物活性评价模型，通过自动化手段，对大量化合物进行生物活性或药理作用的检测，从中发现活性化合物。其主要筛选策略分为基于靶点的筛选和基于表型的筛选。其中，基于表型的高通量筛选，通过在动物疾病模型或细胞模型上筛选能够改变表型的化合物，再深入探索化合物发挥药理作用的靶点及作用机制。这种策略是发现作用于新靶标的新化合物的有效途径，并且对于机制不明确的疾病，表型筛选可以提高药物筛选的成功率。

随着药物发现进程的加快，越来越多通过表型筛选得到的活性先导化合物和天然产物的作用机制亟待明确，而作用靶点的确认成为新药研发的主要瓶颈。常见的靶点识别和确证方法中，用探针标记化合物的方法费时费力，可能会降低或改变化合物的活性。近年来开发的无需对化合物进行标记的方法，逐渐成为活性化合物靶点研究的重要手段。

利用化学蛋白质组学技术，可以直接检测小分子化合物与靶蛋白的相互作用，这些技术主要通过采用药物与靶蛋白结合后使其稳定性发生改变的原理，来识别化合物可能作用的靶点，主要包括细胞热迁移技术（cellular thermal shift assay, CETSA）、药物亲和反应的靶点稳定性（drug affinity responsive target stability, DARTS）、有限蛋白水解质谱技术（Limited proteolysis‐coupledmass spectrometry, LiP-MS）、氧化速率蛋白稳定性（stability of proteins from rates of oxidation, SPROX）、溶剂诱导蛋白质沉淀（solvent-induced protein precipitation, SIP）等。

一、细胞热迁移技术（CETSA）

CETSA技术最初是为了帮助抗癌药物靶向研究而开发出来的方法，它是第一种广泛应用无标记方法来研究药物靶向完整细胞的方法。CETSA主要基于化合物与靶蛋白结合后热力学稳定性发生变化的原理。将化合物和空白对照分别与样本孵育之后，在不同的温度梯度下分别进行加热。经过加热后，孵育体系中仍保持折叠状态的配体结合蛋白相对稳定，而没有结合配体的蛋白会解折叠，从而迅速变性产生沉淀。之后利用免疫印迹（Western-Blot，Fig. 2A）或者基于质谱（Fig. 2B, Fig. 2C）的方法根据其熔解曲线分析可溶性蛋白的热稳定性，从而确证化合物与细胞内蛋白的结合。CETSA技术可以用于活细胞、细胞裂解液及动物组织样本中药物与靶点结合的确证等研究。

二、药物亲和反应的靶点稳定性（DARTS）

DARTS是根据小分子药物与其靶标蛋白结合后导致对蛋白酶敏感性下降而发展起来的一项新技术，由于无需药物保护性修饰且无药物活性依赖性，因此可广泛应用于药物筛选与靶点鉴定。DARTS实验需要用特定的方法对酶解效果进行检测，常用的方法有SDS-PAGE、胶染色技术（如考马斯亮蓝染色）等，此外也可以运用蛋白二维电泳（2D-PAGE）、凝胶或非凝胶质谱（LC-MS/MS）等方法进行检测｡通过比对，识别药物组与对照组酶解的明显差异，进而找到药物的候选靶点进行后续实验确证｡

三、有限蛋白水解质谱技术（LiP-MS）

另外一种新型蛋白质组学技术LiP-MS也利用了 DARTS 中使用的相同生物物理学原理（Fig. 4）。蛋白质组提取物经过双蛋白酶消化步骤，首先在自然条件下用非特异性蛋白酶消化，之后在变性条件下用序列特异性蛋白酶完全消化。接下来，应用鸟枪法蛋白质组学方法分析处理后的多肽样本，通过分析药物组和对照组的LiP产物中多肽丰度，可以发现结构发生变化的特征多肽片段，进而确定药物作用位点。

四、氧化速率蛋白稳定性（SPROX）

与DARTS类似，SPROX是另一种基于配体诱导的靶点稳定性的检测方法。不同于DARTS技术检测蛋白酶解变化，SPROX主要检测靶蛋白的甲硫氨酸的氧化水平（Fig. 5A）, 利用的原理是药物与靶点结合后可以增加靶蛋白的抗氧化能力。当蛋白复合物与化合物孵育后,在化学变性剂存在下使用过氧化氢等氧化剂氧化蛋白。然后采用不同类型的质谱技术（如LC-MS/MS）对选择性氧化的甲硫氨酸进行定量。这种技术利用甲硫氨酸残基的氧化速率分析蛋白质折叠或展开反应的热力学性质, 能够检测分析与药物相互作用的多个靶点蛋白, 亦能够对化合物结合靶点蛋白的亲和力进行定量。

此外，SPROX技术还可以与SILAC（stable isotope labeling by amino acidsin cell culture）技术相结合（Fig. 5B）。SILAC原理为在细胞培养时，采用含有轻（L）、重（H）同位素型必需氨基酸的培养基进行细胞培养，细胞在传代培养过程中同位素氨基酸将被细胞用于合成蛋白质，细胞经传代培养5-6代后，细胞的所有蛋白质将被同位素标记。之后经过SPROX流程，测定L/H的比率，显著差异的即为可能的靶蛋白。

五、溶剂诱导蛋白质沉淀法（SIP）

SIP技术是基于小分子药物与其靶标蛋白结合后对有机溶剂耐受性提高的特点而开发的。细胞裂解液用梯度浓度的有机溶剂（acetone/ethanol/acetic acid = 50:50:0.1）处理，从而发生蛋白变性和沉淀。随后对样品离心，收集上清液进行定量分析。采用的蛋白质组分析方法是稳定的同位素二甲基标记法，同一溶剂浓度的样品经药物处理或未经药物处理的两组数据组合在一个质谱图中进行比较分析，偏离较大的为可能的靶蛋白。

总结：以上这些无标记靶点鉴定方法均利用了配体结合蛋白后蛋白生物物理性质特征变化的特点，可以广泛应用于蛋白靶点的鉴定。随着蛋白质组学、基因组学和生物信息学以及质谱技术的发展和更新, 更多的新技术将会整合不同技术的优点，从而更加明确地阐明药物的作用机制及毒性, 为解决新药研发、药物机制研究、人类疾病标志物识别等难题提供重要的方法基础。关注陶术生物药物筛选一站式平台了解更多。

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