知识分享 | 如何结合过滤器避免上游支原体污染

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知识分享 | 如何结合过滤器避免上游支原体污染

作者：乐纯生物（BLA联合发起单位）

引言

近年来，国内生物技术行业发展迅猛，已成为人类健康和制药领域新的风向标，尤其是基于细胞培养和表达的工艺流程，是各种创新治疗产品的关键环节，例如基于CHO细胞体系的抗体或重组蛋白、基于HEK293或昆虫表达体系的病毒载体等。

在细胞培养工艺中，培养基的污染是大家谈论较多的话题。通常情况下，培养基污染可划分为化学污染和生物污染，化学污染包括培养基杂质、内毒素、去垢剂等。生物污染则包含真菌和细菌污染、支原体污染、病毒污染等。

其中，支原体污染是上游科学家最为看重也最为担心的事件。细胞培养过程中支原体的污染可能来源于培养基或添加剂本身、设备和环境、以及操作者等。据文献数据报道，培养基受到单一种群支原体污染的比重约为5-35%，而受到两种或两种以上种群支原体污染的比重则高达7-60%。因此，在细胞培养工艺中，如何有效降低支原体污染的风险，已成为生物工艺中的重要一环。

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支原体是一类体积细小（约0.1-0.3μm）、圆形或者丝状的，缺乏肽聚糖类细胞壁的细菌的统称，基于这样的特点，一定数目的支原体可以穿透通常意义上0.2μm的除菌过滤膜，并导致下游料液的污染。因此，在培养基制备的过程中，越来越多的研究员考虑采用0.1μm的过滤膜来降低支原体污染的风险。

与除菌级过滤器类似，部分技术文件提出了过滤器的供应商需对0.1μm除支原体过滤器进行一系列的性能确认（Filter Qualification）的建议，这些确认项目包含但不限于下列内容：

• 与细菌截留实验相关联的完整性测试数据
• 支原体去除研究（支原体截留测试）
• 水流速与压力曲线
• 灭菌稳定性测试
• 生物兼容性测试
• 化学兼容性数据
• 可提取物测试
• USP相关测试
  

其中，支原体去除研究是评估过滤器降低支原体污染风险的关键性能指标，也是过滤器供应商评估其产品性能的关键要素。完善的支原体截留测试通常包含以下几个重要的考量点：

1） 模式支原体选择和培养制备方式

• 模式支原体：建议采用Acholeplasma laidlawii (ATCC23206)或等效来源菌种，该模式支原体是常见的培养基污染物，能够穿透0.2μm除菌过滤膜，并且在实验室条件下易于高密度培养，是人体非致病性支原体。通常情况下，建议菌种传代次数不超过15次。

  
  
• 培养基：建议采用MTFB (Mycoplasma Task Force Broth)培养基，配制和灭菌方式参见PDA技术报告。
  
  
• 缓冲液：用于菌体稀释和挑战，建议采用磷酸盐缓冲液 (PB), 配制和灭菌方式参见PDA技术报告。
  
  
• 支原体挑战浓度：建议≥107CFU/cm2。
  
  

2） 挑战用过滤器

• 0.1μm过滤器，用于支原体截留测试，可以是膜片形式，比如47mm直径膜片，配合夹具构成测试用过滤装置，也可以采用商品化过滤器，比如10英寸过滤器。
  
  
• 0.2μm过滤器，用于阳性对照，过滤器形式和测试过程应尽量与挑战用过滤器相同。
  
  

3） 测试装置

• 恒压过滤，可采用压缩空气和压力罐的装置进行测试，应尽量采用较高的测试压力，比如30psi或者更高。
  
  
• 恒流过滤，也可采用恒流泵和压力表的装置进行测试，应尽量采用较高的流速，比如500LMH或者更高。
  
  
• 完整性测试仪，用于检测过滤器的完整性指标。
  
  
  

4） 评估标准

• 0.1μm过滤器的支原体去除性能可以用TR（Titer Reduction）或者LRV（Log Reduction Value）来衡量。
  
  
• 具有优质性能的除支原体过滤器，单位平方厘米（cm2）的有效过滤面积应至少可以截留107CFU模式支原体。
  
  
• 用于阳性对照的0.2μm过滤器，滤过液中应能检测到模式支原体。
  
  
• 测试前后，测试用过滤器和阳性对照过滤器，均通过了完整性测试。
  
  

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乐纯生物即将推出性能优越的 ，其主要特点包括：

• 双层0.2+0.1μm，具有优秀的支原体截留性能
• 高度非对称结构聚醚砜（PES）材质过滤器，流速快，载量高
• 过滤器规格齐全，可提供从180cm2到1.32m2的各种规格囊式过滤器
• 可耐受高压蒸汽灭菌和辐照灭菌，适于搭配一次性管路套件使用
• 出厂前100%完整性测试通过
• 完善的文件体系
• 本地化生产，供应链稳定
  
  

参考资料

1. L. Nikfarjam et. al., Prevention and Detection of Mycoplasma Contamination in Cell Culture, 2011

2. Z. Soheily et. al., Detection of Mycoplasma Contamination of Cell Culture by A Loop-Mediated Isothermal Amplification Method, 2018

3.BSR/PDA Standard 05-201x, Consensus Method for Rating 0.1 Mycoplasma Reduction Filters, drafted stage, 2020

【关于乐纯生物】

上海乐纯生物技术有限公司，成立于2011年，是先行从事生物制药行业一次性使用耗材及设备研发、生产和销售的高新技术企业。乐纯生物十余年持续赋能生物医药，以技术创新为驱动，提供高品质的生物工艺解决方案，致力于成为全球生物制药企业最信赖的合作伙伴。

乐纯生物深耕生物制药领域，广泛服务于抗体、疫苗、细胞和基因治疗等高科技客户；专注一次性工艺技术产品解决方案，全方位应用在生物工艺中的上游细胞培养、下游纯化以及最终制剂灌装等流程，并伴随生物制药全生命周期，贯穿于研发、中试及商业化生产阶段；引领一次性工艺技术快速本土化的进程，打通了上下游产业链。
乐纯生物拥有多个一次性耗材和设备的生产加工基地，为客户提供高质量的定制化生物工艺解决方案。率先创建了C+A级洁净厂房，一次性生物反应器装配车间，现有万级以上洁净生产车间面积已超5000㎡，一次性生物制药耗材年产能达120万套；一次性工艺智能设备年产能达2500套。
乐纯生物拥有生物医药一次性工艺相关核心专利技术30余项，产品具有安全、可靠、低成本、环保等多重优势，帮助生物技术及制药企业更好地符合新版 GMP、环保和 EHS 等要求。

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【关于生物制药国产化推进联合会 BLA】

生物制药国产化推进联合会，英文全称Biopharma Localization Association，缩写BLA。由生物制药研发、生产企业及服务商（含生物制药上下游各细分领域）等共同发起组成，联合会为推动生物制药国产化而生。BLA目标：使BLA成为中国生物制药企业信赖的组织。BLA，for Biopharma，for China.

入会咨询：杨老师，13788930955（微信注明：BLA）

邮箱：blachina2021@163.com

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