【菌周刊】多形汉逊酵母表达系统介绍

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酵母是一种单细胞真核微生物﹐与原核生物比起来，其具有生长快、遗传操作简单的特点，又有哺乳类细胞的翻译后加工和修饰功能，因此非常适合用于生产来源于真核生物的生物活性蛋白。酿酒酵母( Saccharomyces cerevisiae)是第一个用于表达外源基因的真核系统，20年来已成功地用于表达来源于人、动物﹑植物和病毒的外源基因，但这一表达系统在工业化生产中存在许多不足：如菌株不稳定、产量和分泌效率低、分泌的多肽链糖基化过度等。
甲醇营养型酵母是最近十年逐渐发展起来的一类可用于表达外源基因尤其是真核生物基因的理想系统，顾名思义就是能在以甲醇为唯一碳源和能源的培养基上生长的酵母菌。这类酵母分属假丝酵母（Candida）、汉逊酵母(Hansenula)、毕赤酵母(Pichia)和球拟酵母(Torulopsis)4个属。与酿酒酵母相比，甲醇酵母外源基因表达系统具有重组菌的遗传性质稳定、表达量高、适于大规模发酵等优点。而多形汉逊酵母（hansenula polymorpha)是其中的佼佼者﹐它是当前国际上公认的最为理想的外源基因表达系统之一，下面菌菌就简单为大家介绍一下这个此前没有提过的品种~一、多型汉逊酵母的生物学性质及优势

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]多形汉逊酵母是一种耐热酵母，最适生长温度为37-43℃（其它甲醇酵母为30℃），最高生长温度达49℃，所以非常适合于生产热稳定的酶和用于结晶学研究的蛋白质。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]多形汉逊酵母属于真菌门/子囊菌亚门/半子囊菌纲/内孢霉目/酵母科/汉逊酵母属，为单细胞低等真核生物。多形汉逊酵母的营养体以单倍体形式存在，有6条染色体，大小为0.9~2.2Mb。天然多形汉逊酵母广泛存在于污染了的橙汁、玉米面、多种昆虫的肠道及土壤中，呈白色﹑奶酪黄油状菌落，不形成菌丝，沿芽殖生长繁殖。

多形汉逊酵母可以达到高细胞密度，能有效地分泌分子量高达150KDa的蛋白，经过800个培养周期，载体还能被稳定地整合到多形汉逊酵母的基因组，提供了一个可靠的蛋白表达过程；能进行准确的翻译后加工；产物表达量高等，是一种潜力巨大的外源基因表达系统。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]二、多形汉逊酵母在生物技术中的应用

2.1筛选标记提供合适的基因标记是筛选转化子的必需工具。目前已构建了多种多形汉逊酵母营养型突变体菌株，相对应携带这些突变体功能互补的同源或异源基因的载体也构建完毕。另外，提供遗传霉素（Geneticin, G418）、博来霉素（zeocin/phleomyci）抗性的基因也已经被成功地应用于多形汉逊酵母中作为筛选标记。2.2 转化与整合操作多形汉逊酵母的分子技术已经发展到同酿酒酵母相似的水平。首选的转化方法是采用电穿孔法。取对数生长中期的酵母细胞，清洗数次后用还原剂DTT处理以弱化细胞壁，加入质粒DNA后﹐使用电脉冲使DNA分子进入细胞内。在汉逊酵母中分离到几个自主复制序列( autonomously replicating sequence，ARS)和别的能促进多形汉逊酵母中质粒自主复制的DNA片段，现这些元件已被应用到不同的表达载体上。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]对多形汉逊酵母的线性和非线性整合都有报道。DNA序列整合可以通过单交换或双交换重组来获得，致使额外的基因插入或置换。整合通过同源基因重组来完成，最常用基因包括甲醇氧化酶和胺氧化酶。线性化质粒发生同源整合的频率仅为1%~22%，这可能是因为在多形汉逊酵母中存在双链缺口修复系统，它能以非同源方式使线性质粒重新环化，从而使质粒能进行复制。这种修复系统的准确率可达50%~68%。

2.3 发酵由于多形汉逊酵母培养温度较高，因而生长、分裂速度较快，生存力强﹐易于培养﹐在廉价的合成或半合成培养基上能高密度生长，菌体密度可达 100~130 g/L湿重，因而外源基因的表达水平较高。其相对高的最优生长温度有利于哺乳动物包括人类蛋白的表达，而且能够提高生长速度，缩短发酵时间，降低对发酵设备的制冷要求，减少大规模培养时污染的风险﹐从而利于大规模发酵生产。现在多形汉逊酵母的发酵一般采用二相发酵法，先用甘油作为碳源培养使生物量达到一定值，然后在培养基中加入甲醇来诱导外源基因表达。因为多形汉逊酵母甲醇代谢途径酶的调节不完全等同于毕赤酵母的阻遏/诱导机制，而是表现为阻遏/解阻遏机制，即在低浓度甘油和葡萄糖中也能高效表达，所以多形汉逊酵母也可采用一步法发酵，从而简化了操作步骤。用葡萄糖代替甘油可以节省成本，不以甲醇为碳源可以降低危险性。三、总结目前，多形汉逊酵母已经成功地表达许多药用、工业用蛋白质及酶制剂如具有诊断和治疗价值的真核生物蛋白，其中许多已得到商业化推广，如水蛭素、乙型肝炎病毒表面抗原Ｂ（ＨＢｓＡｇ）、人干扰素（ＩＦＮａ－２ａ）、胰岛素等，同时国内也在积极推进汉逊酵母表达生产HPV、HEV疫苗，如瑞科生物重组HPV九价疫苗REC603。另外还有多种外源蛋白在多形汉逊酵母中成功表达的报道。多形汉逊酵母是一种具有自身优势与巨大潜力的外源基因表达系统，必将有广阔的应用前景。耀海生物重组多肽/蛋白平台基于大肠杆菌和酵母表达系统，已成功交付多个重组多肽生产项目（包括GLP-1类似物），具有丰富的重组多肽发酵、纯化、酶切、修饰、制剂罐装、冻干和质量检测服务经验，全速推进重组多肽或蛋白类生物制品的开发进程。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]重组多肽或重组蛋白业务详情：业务介绍 | 耀海生物重组蛋白CRDMO一站式服务

参考文献

[1]The 3rd Hansenula polymorpha Worldwide Network Conference(HP-WN-3): Strengthening the connection between fundamental researchand its biotechnological application. Alghero，Sardinia，Italy，25-29September 2004[J]. FEMS Yeast Res，2005，5:491[2]The 2nd Hansenula polymorpha Worldwide Network Conference:Increasing power of Hansenula polymorpha in fundamental researchand biotechnological application. La Laguna，Tenerife，Spain，2002[J].FEMS Yeast Res，2003，3:5[3] Lutz MV，Bovenberg RAL，van der Klei IJ， et al. Synthesis of Penicillium chrysogenum acetyl-CoA: isopenicillin N acyltransferasein Hansenula polymorpha: Fisrt step towards the introduction of anew metabolic pathway[J]. FEMS Yeast Res，2005，5:1063[4] Wu Jiangxue，Fu Wuzhao，Luo Jinxian，et al. Expression and purification of human endostatin from Hansenula polymorpha[J]. Pro-tein Expression Purification，2005，42:12[5] Song Houhui，Zhou Li，Fang Weihuan，et al. High-level expression of codon optimized foot -and-mouth disease virus complex epitopeand cholera toxin B subunit chimera in Hansenula polymorpha [J].Biochem Biophys Res Communications，2004，315:235

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)][6] Park Buem-Seek，Vladimir A，Kim Chul Ho，et al.Secretory production of Zymomonas mobilis levansucrase by the methylotrophicyeast Hansenula polymorpha[J]. Enzyme Microbial Technol，2004，34:132

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