基于质谱 (MS) 的定量蛋白质组学技术 - MedChemExpress

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基于质谱的定量蛋白质组学已成为生物学研究的有力工具，而质谱本质上是不能用于蛋白质定量分析的，因为不同的蛋白质和多肽具有不同的离子化效率，而稳定同位素标记的氨基酸（如 2H(D)，13C，15N 和 18O）引入蛋白质中可以很好的解决这个问题。细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记技术 (Stable  isotope  labeling  by  amino  acids  in  cell  culture, SILAC) 是基于质谱 (MS) 的定量蛋白质组学中一种简单、稳定而强大的方法。它于 2022 年被丹麦 Mann 实验室的 Ong 等人首次用于定量蛋白质组学，可提供准确的相对定量，无需任何化学衍生或者其它操作，广泛用于研究细胞生物学、生物化学、药物学等研究领域[1][2][3][4]。
下面就跟着 M 君先来探索下 SILAC 的技术原理及实验流程吧~


▐  SILAC 基本原理及流程基于代谢将稳定同位素标记的氨基酸整合到整个蛋白质组中，两组细胞同时培养，一组是包含正常（轻）氨基酸（Light）的培养基培养（图 1a，左），另一组组则为同位素标记或者含有“重型（Heavy）”的氨基酸培养基（图 1a，右）。
细胞传代培养 5-6 代后，稳定同位素标记的氨基酸完全掺入到蛋白中，取代了原有的氨基酸，两个蛋白之间就存在分子量的改变，而无其它化学性质的差异。然后将两组细胞混合，提取出蛋白质后酶解，并用质谱（LC-MS/MS）检测分析[1]。

图 1. SILAC 实验概述[1]。

SILAC 实验包括两个不同的阶段 —— 适应 (a) 和实验 (b) 阶段。
(a) 在适应阶段，细胞在轻的和重的 SILAC 培养基中生长，直到重的细胞完全融入重的氨基酸 (红星)。这使得两个 SILAC 细胞池可以通过 MS 完全区分 (黑点和红星，分别表示轻和重 SILAC 肽)，然后可以混合并作为一个样品处理。适应阶段可以包括细胞扩增以达到实验所需的皿数。
(b) 在第二阶段，两个细胞群被不同的处理，诱导蛋白质组的变化。混合样品，亚蛋白质组可通过富集步骤或其他分离纯化，消化成肽作为一个单一池，并通过 MS 进行蛋白质鉴定和定量分析[1]。


▐  SILAC 技术中同位素标记氨基酸的选择理想情况下，SILAC 氨基酸应该是培养细胞存活所必需的氨基酸，从而确保特定氨基酸的来源是培养基。亮氨酸[1][5]、赖氨酸和蛋氨酸是必需氨基酸，已被用于 SILAC[6][7]。
在早期的 SILAC 研究中，选择氘 (2H) 标记的亮氨酸作为标记氨基酸[1][5]。然而，氘标记的肽在反相色谱期间的层析位移影响了定量的准确性。后来使用了 13C 或15N 标记的氨基酸，因为这些 SILAC 肽对在 LC-MS/MS 分析中会发生共洗脱[3]。
虽然精氨酸 (R) 不是一种必需氨基酸，但它已被证明对许多培养的细胞系是必需的，并已成功用于 SILAC 标记。由于在后续的蛋白质谱分析之前，要先用胰蛋白酶 (Trypsin) 将蛋白“切割”成肽段，Trypsin 特异性地从蛋白质的赖氨酸 (K) 和精氨酸 (R) 残基处“切割”，最终超 95% 的肽段都是以 K 和 R 结尾，这也使其质谱定量信息更丰富，定量结果更精准。因此越来越多的研究者采用 13C 和15N 标记的精氨酸和赖氨酸的组合作为标记氨基酸[3]。
酪氨酸是另一种在 SILAC 中使用的非必需氨基酸。采用重标记酪氨酸鉴定酪氨酸激酶的底物，研究蛋白酪氨酸磷酸化的动态变化[8][9]。常用的培养基中的轻重氨基酸列表如下：

表 1. 常用的培养基中的轻重氨基酸。

基于 SILAC 的定量蛋白质组学可以用于鉴定外源性蛋白质-蛋白质相互作用 (Protein–protein interactions, PPIs)(图 2A)、内源性 PPls (图 2B)、或诱导型 PPls 中的特异性相互作用蛋白 (图 2C)[3]。

图 2. SILAC 定量相互作用蛋白质组学[3]。

研究外源蛋白复合物时 (图 2A)，野生型细胞或表达亲和标签蛋白的细胞在轻或重的培养基中生长。然后从轻和重细胞裂解物的混合物纯化免疫亲和蛋白复合物[3]。
研究内源性蛋白复合物时 (图 2B)，在轻或重培养基中生长的细胞中通过 RNAi 敲低所靶蛋白。然后用来自轻和重细胞裂解物混合物的相应抗体对蛋白质复合物进行免疫沉淀[3]。
在诱导型 PPls 的情况下 (图 2C)，通过在轻或重培养基中生长的细胞中的特异性刺激来诱导蛋白质复合物，然后从轻和重细胞裂解物的混合物中免疫亲和纯化。获得蛋白质复合物后，将蛋白质消化成肽并用 LC-MS/MS 进行分析。特异性相互作用蛋白或非特异性背景蛋白可以通过它们的 SILAC 比率来区分[3]。


至此，同位素标记氨基酸与 SILAC 的亲密关系解密完成，此外，小 M 还整理了 SILAC 的技术优势 ，一起看看吧~

表 2. SILAC 技术优势。

总之，同位素标记氨基酸为 SILAC 的广泛应用奠定了很好的基础，同时也让同位素标记氨基酸与定量蛋白质之间的关系更加密不可分，你是否也想让你的实验设计更进一步呢？MCE 可为您提供一系列同位素标记氨基酸 ，助力您的科学研究！

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L-Lysine-13C6 dihydrochloride 人类必需的氨基酸。

L-Arginine-13C6 hydrochloride 合成一氧化氮的氮供体，是血管扩张剂。

L-Leucine-d10 一种必需的支链氨基酸。

L-Proline-13C5 人体中二十种氨基酸之一，用于构建蛋白质。

L-Methionine-13C5 一种必需氨基酸。

L-Valine-d8 一种必需氨基酸。

γ-Aminobutyric acid-d6 是成年哺乳动物大脑中主要的抑制性神经递质。

L-Tryptophan-d5 一种必需氨基酸。

特级胎牛血清，乌拉圭 MCE 胎牛血清 (Fetal Bovine Serum) 来源于非疫区健康牛 (不含 BVDV、PI3、IBR、BTV 等牛源病毒)，由剖腹产 6-8 月龄胎牛的血液制备而成，产地乌拉圭。

MEM 非必需氨基酸溶液 (100×) MEM 非必需氨基酸溶液 (100×)，是已经过滤除菌，可直接使用的常用细胞培养添加剂，其主要促进细胞生长和存活，减少体外细胞的生物合成负担。

青霉/链霉素双抗溶液 Penicillin-Streptomycin (100×), Sterile 是已过滤除菌，可直接用于细胞培养的双抗溶液。

抗生素-抗真菌素溶液 MCE Antibiotic-Antifungal (100 ×), Sterile 含青霉素（10 KU/mL）、链霉素（10 mg/mL）、两性霉素 B（25 μg/mL）。青霉素-链霉素可有效抑制多数革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的生长，两性霉素 B 可用于抑制真菌、酵母的污染。

无血清/无蛋白细胞冻存液 MCE 无血清无蛋白细胞冻存液是一种非程序性即用型细胞冻存液。该产品既适用于常规哺乳动物细胞的冻存，也适用于无血清培养细胞的冻存。

MCE的所有产品仅用作科学研究或药证申报，我们不为任何个人用途提供产品和服务。

参考文献:
[1] Ong SE, et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Mol Cell Proteomics. 2002 May; 1(5):376-86.

[2] Krijgsveld J, et al. Metabolic labeling of C. elegans and D. melanogaster for quantitative proteomics. Nat Biotechnol. 2003 Aug; 21(8):927-31.

[3] Chen X, et al. Quantitative proteomics using SILAC: Principles, applications, and developments. Proteomics. 2015 Sep; 15(18):3175-92.

[4] Ong SE, et al. A practical recipe for stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC). Nat Protoc. 2006; 1(6):2650-60.

[5] Foster, et al. Unbiased quantitative proteomics of lipid rafts reveals high specificity for signaling factors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003, 100,5813–5818.

[6] Everley, et al. Quantitative cancer proteomics: stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) as a tool for prostate cancer research. Mol. Cell Proteomics 2004, 3,729–735.

[7] Ong, et al. Identifying and quantifying in vivo methylation sites by heavy methyl SILAC. Nat.Methods 2004, 1, 119–126.

[8] Ibarrola, et al. A novel proteomic approach for specific identification of tyrosine kinase substrates using [13C] tyrosine. J. Biol. Chem. 2004,279, 15805–15813.

[9] Tzouros, et al., Development of a 5-plex SILAC method tuned for the quantitation of tyrosine phosphorylation dynamics. Mol. Cell Proteomics 2013, 12, 3339–3349.

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2017 年，类器官被 Nature Methods 评为生命科学领域年度技术，可谓是潜力无限。之前，小 M 也已为大家介绍过类器官。今天，小 M 又给大家带来了重磅新星：“二代” 类器官，请查收~
类器官是由胚胎干细胞 (ESCs) 或诱导多能干细胞 (iPSCs) 衍生而来的体外 3D 细胞簇，与起源组织具有相似的组织学特征和功能。相比于传统 2D 培养，类器官更具生理相关性，已被广泛用于疾病研究和药物开发。
尽管已有成熟的方法可以构建肿瘤、肠道、心脏和视网膜等多种类器官，但目前的类器官通常仅包含单一种类细胞，缺少体内微环境的复杂性。
例如，肿瘤类器官的培养中通常仅包含癌细胞，缺少肿瘤微环境 (TME) 细胞和肿瘤外部压力 (如缺氧或免疫调节)，使得整个类器官复杂性大大降低，难以研究细胞外基质在驱动癌症类器官表型和药物敏感性中的机制[1][6]。
而对于肠道类器官而言，亦是如此。在过去十年中，源自多能干细胞的人肠道类器官  (Human intestinal organoids, HIOs) 提高了我们对人肠道发育和疾病的认识，为研究人类肠道器官发生和生理学提供了有价值的模型，但它们缺乏完全重现人类肠道生物学和疾病复杂性所需的免疫成分，难以模拟人肠道生物学和疾病的复杂性。

图 1. 肠道类器官及肠上皮边界的免疫细胞概述[1]

A：肠道类器官培养缺乏肠上皮微环境的任何细胞成分。小鼠小肠类器官在体外自发产生两个特化结构域：隐窝样结构域 (The crypt-like domain) 和绒毛样结构域 (The villus-like domain)。B：稳定状态下在肠上皮边界发现的常驻免疫细胞概述。肠上皮包含 αβ T 细胞受体 (TCR)+和 γδ TCR+上皮内淋巴细胞 (Intraepithelial lymphocytes, IELs)，而肠固有层包含不同亚群的树突状细胞、巨噬细胞、T 细胞、产生 IgA 的浆细胞和固有淋巴样细胞 (Innate lymphoid cells, ILCs) 等等。



虽然类器官仍存在以上种种局限性，但别慌！科学家们已开启了“二代”类器官的新时代！话不多说，快来跟着小 M 来看看首次构建的包含功能性免疫系统的体内类器官吧~

近期，Carine Bouffi 等人 在 Nature Biotechnology 上发表了题为“In vivo development of immune tissue in human intestinal organoids transplanted into humanized mice”的研究成果。
作者将人肠道类器官 (HIO) 移植到具有人源化免疫系统的小鼠 (NSGS) 的肾囊下，生成了含有免疫细胞的 HIO。进一步研究发现人类免疫细胞可暂时迁移到粘膜并形成类似于人类肠道淋巴滤泡的细胞聚集体。此外，接触微生物后，上皮微褶皱细胞 (Microfold cells，M cell) 数量增加，导致 HIO 腔中 IgA 抗体的分泌并决定免疫细胞活化[7]。该文成功开发出“二代”肠道类器官(Next-generation HIO system)，下面，且听小 M 来为大家细细解读~

▐  模型构建
实验工作流程如下图所示：

图 2. 人源化小鼠模型验证述[7]。

将体外 HIO 移植到人源化 (NSGS) 小鼠体内，移植后第 12、16 和 20 周，收集 HIO 和目标组织进行分析 。注: NSGS 小鼠: NOD/Scid Il2rg null Tg (hIL3、hGM-CSF 和 hSCF) 小鼠。

1. HIO 构建a) 培养人 H1 胚胎干细胞：在 mTESR1 培养基中无饲养层条件下培养 WA-01 细胞。
b) 诱导确定的内胚层：用 Accutase 分离细胞，以每孔 7-10 万 个的细胞密度铺板于基质胶包被的 24 孔板中。达到 80-95% 融合度时，用 100 ng/mL Activin A  处理 3 天。
c) 诱导中后肠球状体形成：用含 500 ng/mL FGF4  和 3 μM CHIR-99021   的后肠诱导培养基处理内胚层 4 天。
d) HIO 生成：将球体铺在基质胶中，用含 100 ng/mL EGF  的肠道生长培养基中持续培养，至产生 HIO。
2. HIO 移植a) 将体外成熟 28 天的单个 HIO 从基质胶中取出，移植到人源化小鼠肾囊下 (具体手术方法可参考原文献)。
b) 在术后 48 h 内进行监测，第 12 周和第 16 周对小鼠实施，收集组织并分析。▐  类器官中肠细胞谱系验证
作者对移植的 HIO 进行了肠道细胞细胞标志物染色，发现在 NSGS 小鼠中移植和分化的人肠道类器官中存在所有主要的肠道细胞谱系，证明了 HIO 的成功构建和移植。

图 3. HIO 移植到人源化小鼠体内的肠细胞谱系表达[7]。

HIO 移植后 12、16 和 20 周时，HIO 切片上的肠道标志物 (红色)、人 CD45 (绿色) 和人 CDH1 (白色) 在 (A) 肠上皮细胞标志物 VIL/Villin、(B) 杯状细胞标志物 MUC2/Mucin2、(C) 潘氏细胞标志物 LYZ/Lysozyme 和 (D) 肠内分泌细胞标志物 CHGA/Chromogranin A) 的共染色。

▐  移植的 HIO 存在免疫细胞浸润
随后，作者通过免疫组化 (IHC) 证明了移植的 HIO 固有层和上皮存在人免疫细胞 (hCD45+ 细胞) 浸润 (图 4A)，并形成与人类胎儿 (图 4B) 或成人肠道免疫类似的细胞聚集体 (图 4C)，说明移植的 HIO 中存在免疫细胞浸润和结构。

图 4. 使用免疫系统人源化小鼠模型将免疫细胞整合到 HIO 中[7]。

A：移植 HIO 后不同时间点用抗-人 CD45 抗体对 HIO 进行 IHC 染色; B: 用抗-人CDH1 抗体 (蓝色)、抗-人 CD45 抗体 (绿色) 和 DAPI (白色) 对人胎儿肠道进行免疫荧光染色; C: 用抗-人 CD45抗体对成人空肠进行 IHC 染色。

▐  类器官中免疫构成与人胚胎肠道发育类似作者还进一步通过质谱流式细胞术 (一种将流式细胞技术与质谱分析技术结合在一起的新技术，用于高纬度和高通量单细胞分析）和免疫组化证实 HIO 中存在 GALT 相关 B 细胞和 T 细胞 （参见原文 Fig 2, 3)。此外，作者还发现移植 HIO 中淋巴样结构的时空发育与胎儿肠道中发育的淋巴滤泡相似，具体表现在 T 细胞/B 细胞聚集 (图 5A)、分区 (图 5B)，粒细胞/浆细胞浸润等等 (图 5C-E)。

图 5. 移植的 HIO 中的淋巴样结构与胎儿肠道中的淋巴发育相关性比较[7]。

A-C: HIO 切片用抗人-CD3 抗体标记 T 细胞 (上)，用抗人-CD4 /CD8 抗体标记 T 辅助细胞/细胞毒性 T 细胞 (中)，用抗人-CD20 抗体标记 B 细胞 (下)。D: H&E 染色显示发育后期 HIO 中的中性粒细胞。E: H&E 染色显示浆细胞，并进行 IHC 染色确认。

▐  病原体侵染后的免疫应答
最后，作者将移植的 HIO 暴露于病原体 (E.coli )，通过检测 M 细胞标志物 GP2，证明了 M 细胞的存在，且与免疫细胞重合 (图 6A-D)，并发现 HIO 的粘液中存在高水平 IgA 抗体 (图 6E)，且 M 细胞和 B 细胞共定位良好 (图 6F)。
由此证明 M 细胞具有转运抗原以激活免疫细胞的功能，以及肠道上皮细胞-免疫细胞存在 Cross-talk，即 HIO 上皮和免疫细胞之间的串扰诱导淋巴样结构的形成以及 M 细胞的分化和功能。

图 6. 移植的 HIO 暴露于病原体 (E.coli)后可诱导 M 细胞产生[7]。

A-C: HIO 切片用抗人-CD45 抗体, 抗人-GP2 抗体, 抗人-MUM1 抗体分别标记免疫细胞, M 细胞和浆细胞。D: GP2 基因表达变化。E: HIO 粘液中的人 IgA 水平变化。F:使用抗人-CDH1、抗人-GP2 和抗人-CD20 进行免疫荧光染色。

本期小 M 为大家介绍了首例肠道“二代”类器官的构建与验证。该研究一定程度上弥补了免疫相关研究的缺陷，为研究肠道发育、相关疾病和药物发现的研究提供了更切实际的的模型。小 M 也相信这项研究也将为其他类器官领域的科学家们和同学们提供新思路~

基质胶 标准型/低生长因子型，有/无酚红基底膜基质胶，用于干细胞/类器官培养。

Activin A 多功能细胞因子，可诱导干细胞分化。

FGF4 常见类器官培养因子，在早期发育中对中胚层诱导、神经发育等有重要作用。

EGF 上皮组织生长因子，类器官培养因子。

CHIR-99021 GSK-3 α/β 抑制剂，诱导干细胞分化，可用于类器官培养。

DAPI DNA 荧光染料，活细胞/固定细胞染色。

抗-人 CD45 抗体 反应物种：人；可用于 WB、IHC-P、FC 实验

抗-人 CD4 抗体 反应物种：人；可用于 WB、ICC/IF、IHC-P 实验

MCE的所有产品仅用作科学研究或药证申报，我们不为任何个人用途提供产品和服务。


参考文献:
[1] Bar-Ephraim YE, Kretzschmar K, Hans Clevers. Organoids in immunological research. Nat. Rev. Immunol. 2020, 20(5): 279-293.
[2] Sato T, et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 2009 May 14;459(7244):262-5.
[3] Ootani A, et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nat Med. 2009 Jun;15(6):701-6.
[4] Clevers H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 2016 Jun 16;165(7):1586-1597.
[5] Kretzschmar K,et al. Organoids: Modeling Development and the Stem Cell Niche in a Dish. Dev Cell. 2016 Sep 26;38(6):590-600.
[6] LeSavage, B.L., et al. Next-generation cancer organoids. Nat. Mater. 2022, 21, 143-159.
[7] Bouffi C, et al. In vivo development of immune tissue in human intestinal organoids transplanted into humanized mice. Nat Biotechnol. 2023, 41(6): 824-831.

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药物递送系统 (Drug Delivery System，DDS) 能够将药物在适当的时机，靶向递送到目标位置，提高了药物的生物利用度，同时降低了药物的毒性。

常用的药物递送载体结构包括纳米 (颗粒、胶束、管等)、脂质体、水凝胶 (微球、海绵状等)、膜控 (包衣、乳剂、涂层、渗透泵等)、骨架等，可根据需要递送的药物类型，选择最合适的载体结构。

图 1. mRNA-脂质纳米颗粒复合物示意图[1]。

MCE 目前可提供一系列脂质纳米颗粒 (LNP) 标准品，作为基因调控和功能研究的报告材料，适用于 RNA 传递、翻译效率、细胞活力等检测。比如包裹了生物发光基因、荧光蛋白、CD 分子等报告材料的 LNP。想要了解更多可以见下表~

表 1. MCE 相关脂质纳米颗粒系列产品。

肥皂，都用过吧？是使用最早的表面活性剂之一。

土耳其红油？又称为红油，是第一个合成的表面活性剂。
后来，随着石油化工的飞速发展，烷基苯磺酸盐成功由苯和制成。

图 2. 表面活性剂示意图[2]。

表面活性剂 (Surfactant) 是指加入少量能使溶液体系的界面状态发生明显变化的物质，被誉为“工业味精”。其分子结构具有两亲性：一端为亲水基，另一端为亲油基。

表面活性剂可分为离子型表面活性剂和非离子型表面活性剂两大类，离子型表面活性剂又可分为阳离子型、阴离子型和两性离子型。想要了解更多可以见下表~

表 2. MCE 相关表面活性剂产品。

等等，还没结束呢！

一部分表面活性剂家族成员在助溶剂队伍里发光发热，看看有没有老朋友~

表 3. MCE 相关助溶剂产品。

MCE 目前可提供 3,000+ 高质量生化试剂，药物递送系统、助溶剂、增稠剂、酶制剂、酶底物、酶抑制剂、缓冲试剂、细胞培养添加物、螯合剂、指示剂、催化剂、基因合成和测序、色谱用试剂等多个类别，另外还有多种荧光探针和染色剂供你挑选哦~


[1] Huang Q, Zeng J, Yan J. COVID-19 mRNA vaccines. J Genet Genomics. 2021 Feb 20;48(2):107-114.
[2] De Angelis, G., Gray, N., Lutz-Bueno, V., et al. From Surfactants to Viscoelastic Capsules. Adv. Mater. Interfaces. 2023, 10, 2202450.

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肿瘤，始终是科研热榜的“TOP1”， 肿瘤除了有“良恶”之别，还有“冷热”之分。今天，咱们就一起来唠一唠肿瘤 “冷热” 机制那些事儿~



“冷热” 肿瘤如何划分？根据肿瘤微环境中免疫细胞的空间分布情况，将肿瘤分为三种基本的免疫表型：免疫炎症型、免疫排斥型和免疫沙漠型。其中免疫炎性肿瘤即为 “热肿瘤”,免疫排斥瘤和免疫沙漠瘤皆可称为 “冷肿瘤”。
简单来讲，“冷”肿瘤缺乏先天免疫，而在“热” 肿瘤中，免疫细胞较为活跃，其内环境也被大量的 T 细胞所浸润。

图 1. 根据免疫细胞分布区分“冷热”肿瘤[1]。

通常情况下，当免疫检查点抑制剂 (ICIs) 解除免疫检查点的抑制作用后，T 细胞对肿瘤的免疫应答效应再次被启动，活化的 T 细胞杀伤癌细胞，起到免疫治疗作用。
因此，具有炎症表型的 “热肿瘤” 往往对 ICIs 更敏感。但对于“冷肿瘤” 来说，免疫细胞很难识别并杀伤，免疫检查点抑制剂也就难以发挥作用，这也是导致“冷肿瘤”对 ICIs 治疗失效的主要原因[1]。
现有研究表明，使细胞毒性效应 T 细胞富集到“冷”肿瘤中，能够使“冷肿瘤”转变为“热肿瘤”从而显著提高肿瘤对免疫检查点抑制剂 ICIs 治疗的反应[2][3]。

图 2. “冷”肿瘤转变为“热”肿瘤[4]。

在肿瘤免疫激活的过程中，冷肿瘤中 T 细胞缺失可能有以下原因[4]：
① 肿瘤相关抗原缺乏；
② 抗原呈递细胞 (APCs) 缺陷；
③ T 细胞活化缺失；
④ T 细胞向肿瘤的运输受损。

▐  肿瘤相关抗原缺乏
人体的免疫系统能够识别健康细胞及肿瘤细胞，因为后者表达肿瘤相关抗原、肿瘤特异性抗原、癌症种系抗原，这些抗原会被体内的 CD8+ T 细胞识别并实现免疫应答[5]。目前研究表明，肿瘤抗原释放的动力学与不同形式的自发或诱导癌细胞死亡相关，最后导致 T 细胞的反应效果[6]。

▐  抗原呈递细胞缺陷
肿瘤免疫在很大程度上依赖于 APCs 介导的效应 T 细胞的启动和激活，而树突细胞 (Dendritic cells, DCs) 是机体功能最强的 APCs。但在很多肿瘤中发现 DCs 是有缺陷的，造成这种缺陷的原因可能是由于肿瘤细胞分泌的细胞因子 (IL-10，IL-8)、生长因子 (VEGF)、信号分子 (STAT3) 等影响了 DCs 的分化、成熟、功能[7]。
▐  T 细胞活化缺失
T 细胞的活化缺失，其主要原因是因为 APCs 的激活或者缺乏共刺激[8][9]。有研究证据表明缺乏或传递 FRP1 变体的 DCs 在抗原呈递和 T 细胞激活失败时，会导致乳腺癌及结直肠癌患者的肿瘤免疫反应，降低总体生存率[8]。
▐  T 细胞向肿瘤的运输受损
T 细胞向肿瘤的运输受损，主要由以下原因造成：免疫抑制肿瘤周围基质和肿瘤细胞改变对 CD8+ T 细胞的排斥作用，最近一项研究就将肿瘤基质细胞与肿瘤免疫中的 PD-L1 应答联系了起来[9]。而肿瘤细胞中 PTEN 的缺失可增加免疫抑制细胞因子的表达，从而导致 T 细胞介导的肿瘤杀伤被抑制，并减少 T 细胞向肿瘤运输[10]。
T 细胞向肿瘤的运输受损的另一个原因是趋化因子及细胞因子的影响，炎症环境下分泌的趋化因子可以使未成熟的 DCs 细胞向肿瘤聚集，并且由 DCs 细胞产生的趋化因子 CXCL16 及其受体 CXCR6 与 CD4+ 和 CD8+ T 细胞募集增有关，因此趋化因子的缺乏可能会导致 T 细胞的募集受损[11][12]。细胞因子则是 DCs 细胞产生活性的必需品，如由 DCs 产生的I型干扰素 (IFN-I) 可以以自分泌方式产生具有活性的 DC1s[13]。


针对冷肿瘤形成的机制，使冷肿瘤转变为热肿瘤的方法有：
① 使用可以诱导表观遗传的药物如 DNA 甲基转移酶抑制剂 DNMTi，来增强肿瘤抗原的表达[14]。
② 利用 NK 治疗法，如离体活化的自然杀伤细胞 (NK) 来改善肿瘤抗原缺乏或抗原呈递机制不足 (如图 3 所示)[15]。
③ 对于 T 细胞活化缺失则可以通过放化疗[16]、溶瘤病毒[17]、PRR 或 CD 40 激动剂[18][19]、肿瘤疫苗等方法来重新启动 T 细胞或与少量活化的 T 细胞产生协同作用[20]。
④ 若 T 细胞向肿瘤的运输受损，则可以将 TGF-β 抗体阻断剂和 TGF-β 受体拮抗剂与 PD-L1 抗体结合使用，共同诱导 T 细胞向肿瘤募集[21]，也可以利用抗血管生成药物来增加T细胞在肿瘤细胞的浸润。
⑤ 开发将特定肿瘤抗原抗体片段与修饰细胞因子相结合免疫细胞因子，来特异性激活肿瘤内的免疫系统并减少全身副作用[22]。

图 3. NK-DC 细胞互相干扰[15] 。

NK 细胞被靶肿瘤细胞或细胞因子激活后，会产生 IFN-γ 和肿瘤坏死因子 (TNF)-α，从而促进 DC 成熟。DC 的成熟也强烈依赖于 NK 细胞上激活受体（例如 NKp30 和 NKG2D）的参与。成熟的 DC (mDC) 反过来会产生白细胞介素 (IL)-12、IL-15 和 IL-18，增强 NK 细胞的细胞毒性和 IFN-γ 分泌。NK细胞还可以通过激活 NKp30 和抑制性杀伤细胞免疫球蛋白样受体以及 NKG2A/CD94 来区分未成熟（iDC）和 mDC 并消除未成熟 DC（iDC），从而维持 mDC 群体的质量（DC editing）。浆细胞样 DC (pDC) 分泌的 IFN-α 可以进一步增强 NK 细胞的细胞毒性。NK 诱导的肿瘤细胞裂解提供抗原，该抗原可以被 DC 吸收用于抗原呈递。一旦成熟，负载抗原的 mDC 将迁移到肿瘤引流淋巴结，将肿瘤抗原交叉呈递给初始 T 细胞，并诱导其分化为肿瘤特异性 CD8+ 细胞毒性 T 细胞和 CD4+ T 辅助 1 (Th1) 细胞。

以上的治疗方法中溶瘤病毒疗法以及肿瘤疫苗是被认为具有强大抗癌活性的新兴疗法。

：溶瘤病毒疗法
溶瘤病毒疗法不仅能够选择性的使肿瘤溶解外，而且通过溶瘤病毒裂解肿瘤细胞而诱导释放的 TAA、PAMP、DAMP 等可以激活体内的先天性和适应性免疫反应，改变肿瘤的免疫微环境使冷肿瘤变为热肿瘤[23]。在实际的应用中，T-VEC 就被证实是可以有效治疗黑色素瘤的溶瘤病毒[24]。临床上联合应用帕博利珠单抗能增加黑色素瘤患者的 CD8+ 细胞浸润及活化[25]。
：肿瘤疫苗
肿瘤疫苗则可以扩大特异性 T 细胞的数量，增加 T 细胞向肿瘤区域的运输[26]。在一项针对晚期恶性黑色素瘤、NSCLC 和膀胱癌患者的 Ib 临床试验中，个体化新抗原疫苗 NEO-PV-01 与 nivolumab 的联合就显著延长了无进展生存期，并观察到特异性T细胞向肿瘤区域的运输及浸润[27]。但无论是哪种治疗，最后都离不开肿瘤机制的探索，每一种机制的发现都会为我们的肿瘤治疗带来指导性的意义。
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BIO8898 BIO8898 是一种有效的 CD40-CD154 抑制剂。BIO8898 抑制可溶性 CD40L 与 CD40-Ig 的结合， IC50 值为 25 μM。BIO8898 抑制 CD40L 诱导的细胞凋亡。

Mitazalimab Mitazalimab (ADC-1013; JNJ-64457107) 是 FcγR 依赖性 CD40 激动剂，具有肿瘤导向活性。Mitazalimab 激活抗原呈递细胞，例如 树突状细胞 (DC)，以启动肿瘤反应性 T 细胞。因此，Mitazalimab 诱导肿瘤特异性 T 细胞浸润并杀死肿瘤。Mitazalimab 可重塑肿瘤浸润性骨髓微环境。

TGFβ1-IN-1 TGFβ1-IN-1 (compound 42) 是一种有效的、具有口服活性的 TGF-β1 抑制剂。TGFβ1-IN-1 可以抑制 TGF-β1 诱导的纤维化标志物（α-SMA 和纤连蛋白）的上调，可用于肝纤维化疾病研究。

SRI-011381 hydrochloride SRI-011381 hydrochloride 是一种有具有口服生物活性的 TGF-β 信号通路的激活剂，具有神经保护作用。

PD-1-IN-18 PD-1-IN-18 是 PD1 信号通路抑制剂，是一种免疫调节剂。

CL845 CL845 是 STING 激动剂 CL656 (HY-112878) 的类似物。CL845 可用于合成靶向 STING（干扰素基因刺激物）的可结合 PRR 配体。CL845 可用于癌症、免疫系统疾病或感染的研究。

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自 2002 年被发现以来，炎症小体一直都是免疫和炎症疾病领域的热门选手，21 年来热度逐年攀升，时至今日，魅力丝毫不减~炎症小体究竟是何方神圣？为啥科研热度居高不下？

▐  什么是炎症小体？“炎症小体”一词最早由 Jurg Tschopp 博士及其同事于 2002 年提出[1]。他们将炎症小体描述为一种“caspase 激活复合物”。炎症小体 (lnflammasomes) 是一种较大的多聚体蛋白复合物，主要存在于攻击病原体的先天免疫细胞中，它在感知外源性病原体或内源性危险信号时会启动炎症反应以及诱导细胞焦亡 。
炎症小体分为两种：经典炎症小体和非经典炎症小体 (图 1)。▐  经典炎症小体
经典炎症小体是由一个感受器蛋白 (主要是 NLR 家族蛋白和 PYHIN 家族蛋白；常见上游感受器蛋白分类见表 1 [2][3][4])、一个衔接蛋白 ASC (NLRC4 炎症小体不需要 ASC) 和一个 Pro-Caspase-1 (Caspase 效应器) 通过 PYD (热蛋白结构域) 和/或 CARD (半胱天冬酶募集结构域) 结合在一起 (图 1C-D)，形成的多聚体蛋白复合物 (图 1A)。

图 1. 炎症小体组装、经典/非经典炎症体示意图[5][6][7]。

A. 经典炎症小体示意图；B. 非经典炎症小体示意图。C. 炎症小体组装部件包含的结构域。D. (以 NLRP3 炎症小体为例) ASC 通过 PYD 和 CARD 两个结构域，将感受器蛋白和 Caspase 效应器衔接在一起，组装成炎症小体；NLRC4 感受器蛋白有 CARD 结构域且无 PYD 结构域，故不需 ASC 即可直接与 Caspase 效应器结合。

▐  非经典炎症小体
非经典炎症小体是由人类 Pro-Caspase-4/Pro-Caspase-5 (或它们的鼠直系同源 Pro-Caspase-11) 与 LPS 构成的大分子蛋白复合物 (图 1 B)。简单来说：
经典炎症小体：感受器蛋白 + ASC + Pro-Caspase-1。非经典炎症小体：Pro-Caspase-4/5/11 + LPS。

表 1. 经典炎症小体常见受器蛋白的分、结构域以及常见激活源[2][3][4]。

注：a. 由于炎症小体组装涉及的结构域为 PYD 和 CARD，故表中仅列出感受器蛋白中是否有这两种结构域；b. 感受器蛋白不一定需要直接与这些信号结合；c. NLRP1 是被发现的炎症小体感受器蛋白；d. Muramyl 二肽 (MDP) 是一种来自革兰氏阳性和阴性细菌的肽聚糖片段。



▐  经典炎症小体活化通路
现有研究认为，经典炎症小体通常需要经历启动（通过炎症刺激: 包括 TLR 配体，如 LPS 和细胞因子，如 TNFα）和激活（常见激活源见表 1）两个连续的步骤才能触发炎症小体的组装[8]。NLRP3 炎症小体研究最为广泛，故以此为例（图 2）。

图 2. NLRP3 炎症小体的激活[8]。

NLRP3 炎症小体的激活经历三个连续的步骤：
1. 启动过程 (信号 1)：包括通过 TLR 识别 PAMP/DAMP 和/或通过 TNFR 感测 TNFα，从而通过 NF-κB 信号传导诱导 NLRP3、pro-IL-1β 和 pro-IL-18 蛋白的表达。
2. 激活过程 (信号 2)：包括多种致病性和无菌炎症信号。3. 效应过程：NLRP3 炎症小体的寡聚化和激活导致 Pro-Caspase-1 转变为活性形式 Caspase-1，Caspase-1 进而剪切下游分子 Pro-IL-1β 和 Pro-IL-18 以及 GSDMD (Gasdermin D)，从而导致 IL-1β 和 IL-18 的释放以及 N-GSDMD 的形成；N-GSDMD 进入细胞膜，形成孔结构，将成熟的 IL-1β 和 IL-18 释放到细胞外空间，诱导细胞焦亡并引起炎症。
值得注意的是，研究表明，K+ 外流是 NLRP3 激活的必要条件，被激活的 NLRP3 与 NEK7 的结合，也是招募 ASC 和 pro-CASP1 组装 NLRP3 炎症小体的必要步骤[7]。
▐  非经典炎症小体活化通路
在非经典炎症小体中，Caspase-4,5,11 直接感知细胞内 LPS，随后组装形成大分子复合物[7]。Caspase-4,5,11 通过剪切 GSDMD，从而实现细胞焦亡 (图 3)。

图 3. 非经典和经典炎症小体活化通路[7]。

另外，GSDMD 孔隙形成也可导致 K+ 流出，从而导致次级 NLRP3 炎症小体激活和相关细胞因子分泌 (也就是说，非经典炎症小体激活后，能够激活经典炎症小体，从而引发 Caspase-1 裂解 Pro-IL-1β 和 Pro-IL-18，导致机体炎症反应)。


炎性小体介导的炎症与多种人类疾病有很大关系，在急性炎症中，炎症小体的激活有助于去除死细胞并启动组织修复。然而，在慢性炎症中，炎症小体的持续激活是有害的，因为它会损伤组织。
NLRP3 炎症小体的激活主要在单核细胞和巨噬细胞中，也可广泛在内皮、上皮和间质细胞中被激活，因此 NLRP3 炎症小体与皮肤、脑、肝脏等不同器官的多种炎症性疾病相关。
此外，突变诱导的 NLRP3 炎症小体组装激活会引发无菌炎症性疾病，包括家族性寒冷型自身炎症综合征 (Fcas)、Muckle-Wells 综合征 (MWS) 和新生儿多系统炎症性疾病。

图 4. NLRP3 炎症小体机制的药理学靶向[8]。

研究表明，操纵炎症小体的激活状态有利于治疗多种疾病[8]。目前，人们已经开发出多种合成小分子、天然化合物和抗体来靶向炎症小体的组装、炎症小体上下游信号通路以及炎症相关受体 (图 4)。例如，MCC950  通过抑制 NLRP3 炎症小体的激活从而改善了糖尿病肾病小鼠模型的肾脏损伤[9]。
此外，小 M 为大家整理了 NLRP3 炎症小体靶向抑制剂的汇总，大家按需收藏喔~

表 2. 靶向 NLRP3 炎症小体的抑制剂汇总[8][9][10]。  

本篇推文为大家详细介绍了炎症小体的分类 (经典和非经典炎症小体)、炎症小体的活化通路、炎症小体的组装方式、以及炎症小体涉及的人类疾病和 NLRP3 炎症小体靶向试剂的研发进展。这些现有成果是 20 多年来众多研究者一步一脚印所摘取的，但我们所揭露的也只是炎症小体的冰山一角，更广阔的未知犹待你我探索！

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MCC950 (CP-456773) MCC950 是一种选择性的 NLRP3 抑制剂，其抑制 BMDMs 和 HMDMs 的 IC50 值分别为 7.5 nM 和 8.1 nM。

Canakinumab Canakinumab 是一种重组的人抗 IL-1β 单克隆抗体，可抑制与自身免疫性疾病相关的炎症。

Glibenclamide (Glyburide) Glibenclamide 是一种具有口服活性的 P2X7R 广谱抑制剂和 ATP 敏感的 K+通道 (KATP) 抑制剂。

Disulfiram Disulfiram 是特异性 caspase-1 抑制剂和特异性的 ALDH1 抑制剂。Disulfiram 能有效抑制人体和小鼠细胞中脂质体中的 GSDMD 孔形成，炎性体介导的细胞凋亡和 IL-1β 分泌。

Acetylcysteine (N-Acetylcysteine; NAC) Acetylcysteine 是一种 ROS 抑制剂。

CY-09 CY-09 是一种选择性的 NLRP3 抑制剂，可抑制 NLRP3 炎症小体的组装。

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[8]  Chen C, et al. Activation and Pharmacological Regulation of Inflammasomes. Biomolecules. 2022 Jul 20;12(7):1005.
[9]  Zhang C, et al. A small molecule inhibitor MCC950 ameliorates kidney injury in diabetic nephropathy by inhibiting NLRP3 inflammasome activation. Diabetes Metab Syndr Obes. 2019 Aug 2;12:1297-1309.

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好专业

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学习了，谢谢提供分享。

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路过，了解。