2025年版药典菌种传代部分的「缺失」

沁人绿茶.

撰稿 | 石决明
来自 | 蒲公英Ouryao

在这个系列的开篇词就说过，2025年版药典指导原则9203中“菌种”部分一个字都没改。

没有改并不代表没有问题，今天我们说的就是菌种传代部分的“缺失”，具体来说就是两处冲突，一点不足和一个词的翻译偏误。


No.1

两处冲突

《中国药典》2020年版9203药品微生物实验室质量管理指导原则"工作菌株的传代次数应严格控制，不得超过5代（从菌种保藏机构获得的标准菌株为第0代），以防止过度的传代增加菌种变异的风险"。

这个要求规定了菌种传代的起点和终点，目的是控制菌种在遗传过程中出现的过度变异，因为过度变异会使标准菌株丧失标准作用。  

但是，关于起点在《中国药典》2020年版通则1121抑菌效力检查法中表述却有不同：“试验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0代）”。干燥菌种其实就是冻干技术制作的标准菌株，按照ATCC的建议冻干菌种应储存在2至8°C，这样更便于运输和分发。  

而对于冷冻菌种（注意不是冻干菌种）的长期储存，ATCC建议使用液氮的气相或-80°C的冰箱。菌种保藏机构必须具有这样的硬件条件，而且要有完整的菌种追溯流程和菌种确认程序，才可以保证菌种在菌种保藏中心保藏期间的变异较小。

从这个意义上来说，并不是大大小小的保藏机构都具有这样的水平。能够提供一份详细的COA是最基础的要求，更好的方式应该是纳入供应商管理，甚至可以去现场审核。

所以，0代是人为划定的起点，只能是认可的保藏机构的菌种。可以说0代是一块金字招牌，代表对保藏机构品质的认可，相当于“嫡系”。  

而任何商业公司使用菌种保藏机构的标准菌株制作的培养物，无论名称是控制菌株、标准培养物、测试菌株还是质量控制菌株，都是派生菌种，相当于“旁支”。其COA上必须注明由菌种保藏机构的标准菌株传代几次制作而得。这就是指导原则9203中提到的“或使用与标准菌株所有相关特性等效的可以溯源的商业派生菌株。”  No.2
一点不足

为了更清楚说明传代控制，指导原则9203中补充了传代的概念：“1代是指将活的培养物接种到微生物生长的新鲜培养基中培养，任何形式的转种均被认为是传代1次。”在实际传代判断中，我们还会对“新鲜培养基”和“接种行为”的尺度区分存在困难。对于微生物来说，很多东西都可以算培养基，比如水、冻干菌种的复融液等等。
  
上图中是微生物学历史上比较有名的彷徨试验，这个实验室为了说明自然突变的存在。但是如果从变异的角度去说：培养前分装到50个小培养管这个操作使变异率有所提高。换句话说，就是改变了培养状态就会提高变异情况。我们可以得出结论：只有生长（或者说产生分裂），才会产生变异。（这里必须停下来，思考1分钟。正是因为繁殖快，微生物的遗传特性才得以明显表达，微生物才更能适应外界环境压力的变化。）那既然变异可能很容易就出现，那微生物转接到水中算不算一次传代呢？比如冻干菌种的重新水化或者复融。  

传代是菌种变异风险比较大的行为，中国药典中的描述存在不足，无法进行清晰界定。而传代定义在USP<1117>微生物最佳实验室实践中为：“一次传代被定义为将微生物从活性培养物转移到新鲜培养基中，并且微生物生长。任何形式的亚培养都被视为转种/传代。”

这就在新鲜培养基的判断标准之外又加上了培养结果的判断。别小看多这半句话，非常重要。  

No.3

翻译偏误

USP<71>无菌检查中要求：“not more than five passages removed from the original master seed-lot”。相应的中国药典指导原则9203中表述，工作菌株的传代次数不得超过5代。

“passage”是“传代”并不是“代”，中国药典中的表述让我们很容易混淆“传代”与“代”的概念，日常使用中经常就会听到“这是几代菌”这样的表述。而细菌的二分裂一次其实也就是十几分钟，5代也就1小时的事情。不信请盯紧下面动图看看。  再加上很多文件中又推荐区分储存菌种和工作菌种。这样确定在标准菌株之外的传代次数时会存在一些困惑。  根据《2023药品GMP指南：质量控制实验室与物料系统》中的菌种传代示例图，我们可以标记上“传代1次”的标签，这样我们就很容易统计一共经过了多少次的传代。  

“5代之乱”的迷宫：设计一个迷宫游戏，迷宫的路径代表菌种的传代过程，终点是一个标有“5代限制”的出口，迷宫中的障碍可以代表传代过程中可能遇到的问题。  

实力所限，做不出来。大家可以想象一下哈  

&#129300;至于为什么是传代5次的限制？这在ATCC的技术报告中有详细的描述，推荐大家去延伸阅读。
  


综上所述，虽然《中国药典》2025年版中指导原则9203中菌种部分没有任何修改，但是细节部分有很多与国外标准存在差距和不同。两处冲突会不会统一描述？半句话的结果判断会不会加上？5代还是5次传代？这些内容如果后续有修订，请给我点赞！  

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互动问题：  

1. 你如何看待0代菌种的“金字招牌”？是否认为这是一种有效的品质保证方式？  

2. 在你的实验室中，是如何区分“新鲜培养基”和“接种行为”的？有没有遇到过什么困难？  

3. 你认为传代5次的限制是否合理？有没有遇到过超过5代的菌种变异情况？  

4. 你如何看待商业公司使用菌种保藏机构的标准菌株制作的培养物？是否认为这是一种可靠的质量控制方式？  

更多观点！欢迎留言！！！

lilian2007177

在使用中没遇到过传代5次以后就变异的情况，有些食品上的菌传代n次也没事，比如检测叶酸之类的鼠李糖，所以一直窃窃以为要求5次传代以内，是菌种保藏中心的商业行为，不控制代次谁还去买呀

李沉思

谢谢分享，学习学习

Melya

谢谢分享，学习了

知之1

lilian2007177 发表于 2024-9-25 09:26
在使用中没遇到过传代5次以后就变异的情况，有些食品上的菌传代n次也没事，比如检测叶酸之类的鼠李糖，所以 ...

这么一说茅塞顿开

lxl8613

请教下各位专家，正常情况工作菌株每个月传代一次，但如果我们使用频率低，可不可以每3个月传代一次