求助：桔梗药材含量测定问题！！

嗯p8aaakta

各位前辈老师，我在做桔梗的含量测定，涉及不同产地多个批次，药典规定对照品浓度为0.5mg/mlL、对分别精密吸取对照品溶液10μl、20μl，供试品溶液10～15μl，注入液相色谱仪，测定，以外标两点法对数方程计算，即得。
不同批次的桔梗药材含量差异很大，峰面积最高可相差10倍，对照品溶液10μl、20μl线性范围太窄。
当我按照药典浓度配制，发现浓度太大，供试品完全不在线性范围之内。稀释至0.2mg/mL 会存在一部分在两点线性范围内，一部分又不在，测出来含量有很多不达标。
（1）我该定怎么定一个对照品的浓度，（2）怎么考虑不在两点范围之内的问题。
刚开始接触液相有好多不懂的 请各位帮帮忙

可亲可爱

药典上的方法是经过验证的，线性也应当验证过的，你修改这个范围可能就是没在验证范围内的。建议还是把样品的称样量修改，符合规定的浓度范围内。

世间始终你好

你的问题非常专业，涉及中药成分的液相含量测定，且你非常清楚自己实验的瓶颈。以下是结合《中国药典》规定与液相色谱的基本原则，对你两个问题的专业分析和建议：

一、你面临的问题概括：

1. **样品之间差异大**，供试品峰面积差异达10倍；
2. **药典规定对照品浓度为0.5 mg/mL，两点法（10 μL、20 μL）线性区间太窄**；
3. 部分样品峰面积远超两点线性范围，超出计算有效区间；
4. 稀释对照品浓度后虽然部分样品落入线性范围，但又有些太低而导致结果“不达标”或失真。

回答你的两个问题：

（1）**我该怎么定一个对照品的浓度？**

原则：

* 外标法的两点线性**必须覆盖样品峰面积的范围**；
* 对照品浓度、进样量、样品处理量，三者灵活调整，**核心是让所有供试品结果都处在外标的线性范围内**；
* 所以药典的配制浓度是参考值，不是绝对值，可以根据实际情况调整。

你的做法建议：

你目前使用0.5 mg/mL、进样10μL、20μL，对应的峰面积太小。可以尝试：

* **降低对照品浓度**，比如调整为 **0.1 mg/mL** 或 **0.05 mg/mL**；
* **扩大进样量范围**，如使用 20 μL 和 40 μL；
* 或反过来：维持浓度不变，**但配制多个稀释倍数**的对照品（如0.5、0.25、0.1 mg/mL）建立覆盖更大范围的线性方程；

推荐方式：
**稀释对照品浓度到 0.1 mg/mL，并进样 20 μL 与 40 μL**（或再稀释为 0.05 mg/mL，进样 20 μL/40 μL）
试跑供试品原液，确保大部分样品峰面积在这对线性点之间。

（2）怎么考虑“不在两点线性范围之内”的问题？
问题的实质：

* 两点外标法**是近似法**，只能用于线性良好的区间；
* 若供试品超出此区间，所计算结果将**不准确甚至错误**；
* **不能直接套用线性外推法（尤其是高含量超出线性范围）**。

解决思路：

建立更宽广的线性范围**：比如做**多点校准曲线（5点线性），不是只用药典两点**；
* 用至少 **5个浓度梯度（如 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5 mg/mL）**，涵盖所有可能的样品浓度范围；
* 使用**线性回归方程**（y = ax + b，或ln形式）计算含量；
* 如果坚持使用两点法，就必须让所有供试品稀释后使其峰面积落在这两个点之间；
* **必要时，稀释高含量供试品溶液**，再进样。

小结建议（实验可行性方向）：

| 问题类型      | 建议方法                                  |
| --------- | ------------------------------------- |
| 对照品浓度不合适  | 自行确定对照品浓度，使其进样量可覆盖大多数供试品的峰面积          |
| 两点法不适用    | 改为**多点外标法**，建立宽线性区间，采用**线性回归**        |
| 供试品不在线性区间 | 高含量样品**稀释处理**；低含量样品可适当浓缩或选更敏感检测条件     |
| 含量测不达标    | 不一定是质量问题，更多可能是线性问题，建议**重做线性验证+供试品稀释** |

ceq518

（1）我该定怎么定一个对照品的浓度
（2）怎么考虑不在两点范围之内的问题。
按药典方法操作，出现问题，多从其他方面考虑考虑，从对照品称样、配制、样品制备、进样、试剂试液；设备稳定性确认，色谱柱正确性，适用性试验；方法是否验证，环境有无影响等多方面，找不到原因，就换个同事做下看看，是否存在相同问题。
不要随便改变药典方法，没有足够研究数据，说明不了变更的准确性，经验证的方法也不是可以随便就改的。

可亲可爱

世间始终你好 发表于 2025-7-9 17:55
你的问题非常专业，涉及中药成分的液相含量测定，且你非常清楚自己实验的瓶颈。以下是结合《中国药典》规定 ...

你是让重新验证吗？

世间始终你好

可亲可爱 发表于 2025-7-10 09:07
你是让重新验证吗？

差不多是这个意思

嗯p8aaakta

ceq518 发表于 2025-7-10 07:32
（1）我该定怎么定一个对照品的浓度
（2）怎么考虑不在两点范围之内的问题。
按药典方法操作，出现问题 ...

你好 谢谢你的回复，现在存在的问题：比如我需要测10批桔梗药材，这十批桔梗药材含量差异很大 ，最低的峰面积为400多，最高的有1000多，按照药典的，对照品进10微升、20微升。对照品峰面积在1200多到1400多。就是外标两点对数，不能把我供试品的的浓度包进去。
请问这个问题该怎么想呢

ceq518

嗯p8aaakta 发表于 2025-7-10 11:52
你好 谢谢你的回复，现在存在的问题：比如我需要测10批桔梗药材，这十批桔梗药材含量差异很大 ，最低的峰 ...

问了一下做药材的同事   他认为：
  1药典方法是没问题的，毕竟是标准；
  2处理样品的时候，注意提取和洗涤的时候的细节，再就是同一个样品的2针跑出来的面积差异在范围内没有；
  3桔梗这个品含量本来就低，稍不注意容易不合格，最好同一台仪器或者用专用色谱柱；
  4十个样品检测时间----相隔长不？是不是同一个检验员做的，不同的人处理样品出来都是有差异的；
  5超声的时候注意水温不要太高了，平行样的含量差异小于1%
判断下是不是OOS，要是排除操作的问题，不合格就判不合格了。

嗯p8aaakta

ceq518 发表于 2025-7-10 14:26
问了一下做药材的同事   他认为：
  1药典方法是没问题的，毕竟是标准；
  2处理样品的时候，注意提取 ...

谢谢你 太感谢了！! ！我再仔细复盘一下操作问题 非常感谢