MSC 检验T细胞增值抑制率

SpringShi

有没有熟悉这个实验的高手，分享点经验给菜鸟，

世间始终你好

你说的“MSC检验T细胞增殖抑制率”，通常是在免疫学和细胞治疗领域里用来评估间充质干细胞（MSC，Mesenchymal Stem Cells）对T细胞活性的抑制效果。简单来说，就是用MSC共培养T细胞，然后检测T细胞在刺激下的增殖能力，计算MSC对T细胞增殖的抑制比例。

SpringShi

有没有详细点的？类似protocol 或者参考资料

SpringShi

CSFE 流式检测的话直接出百分比吗

世间始终你好

SpringShi 发表于 2025-7-23 13:29
有没有详细点的？类似protocol 或者参考资料

当然可以！下面是一个详细的“MSC抑制T细胞增殖”实验protocol（方案），适用于体外共培养实验，含主要步骤、关键参数和注意事项。文末也附带了参考文献供深入阅读。

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MSC抑制T细胞增殖功能实验 Protocol（以CFSE法为例）

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一、实验目的评估间充质干细胞（MSC）对T细胞增殖的免疫抑制能力，为细胞治疗产品研发、放行标准、药效机制研究等提供支持数据。

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二、实验材料与试剂[td]

材料 / 试剂	说明
MSCs	来源清晰的间充质干细胞，预先贴壁生长、计数、复苏
T细胞或PBMCs	人外周血分离的新鲜或冻存PBMC，或纯化T细胞（CD3+）
CFSE染料	细胞分裂追踪染料（如Thermo Fisher, Invitrogen）
抗CD3/CD28刺激抗体	激活T细胞用（如Dynabeads™ CD3/CD28 beads）或可溶性抗体
RPMI 1640培养基	加10% FBS、1% P/S、可加IL-2（如有需要）
96孔板	圆底（悬浮）、U型或V型板
流式细胞仪	带有FITC通道，适配CFSE分析

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三、实验流程1. MSC准备

• 将MSC培养至80~90%融合度；
• 胰酶消化、计数；
• 分装入96孔板中，每孔根据设定的MSC:T细胞比例加入，如：
  
  • 1:1（1×10⁵ MSC + 1×10⁵ T细胞）
  • 1:2
  • 1:5
  • 1:10
    
• 可根据实验设计提前24小时贴壁，或同步接种（看是否考虑MSC分泌影响）。
  

2. T细胞标记

• 分离PBMC后计数；
• CFSE染色（一般2-5 uM，室温染色10分钟，避光）；
• 用RPMI完全培养基终止染色，洗两次。
  

3. 共培养设定

• CFSE染色后的T细胞按比例加入MSC孔中；
• 加入抗CD3/CD28刺激（一般beads:T细胞 = 1:1，或可溶性抗体）；
• 设置对照组：
  
  • T细胞 + 刺激（无MSC）：阳性对照
  • T细胞不刺激（无MSC）：阴性对照
  • T细胞 + MSC（无刺激）：背景
    
• 每组设复孔，推荐3孔以上；
• 培养温箱37℃，5% CO₂，时间通常为3–5天。
  

4. 流式检测

• 收集细胞，洗涤；
• 可染CD3或CD4/CD8表面标志物（若想区分T亚群）；
• 流式检测CFSE染色图谱；
• 使用FlowJo或FCS Express分析T细胞的分裂峰（每次分裂CFSE荧光减半）。
  

5. 数据处理

• 计算“无MSC组”的T细胞增殖峰百分比作为100%；
• 各共培养组的增殖率相较于无MSC组计算抑制率：
  

抑制率=(1−共培养组T细胞增殖率刺激组T细胞增殖率)×100%\text{抑制率} = \left(1 - \frac{\text{共培养组T细胞增殖率}}{\text{刺激组T细胞增殖率}} \right) \times 100\%

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四、注意事项

• **CFSE浓度控制：**太浓会抑制增殖，建议2–5 μM试剂优化；
• **MSC贴壁情况：**MSC贴壁状态对结果有影响，建议前一天接种；
• **刺激强度一致性：**确保CD3/CD28用量一致；
• **MSC Passage数：**用P3-P6代最合适，过高影响免疫调节功能；
• **流式门控：**可标记CD3/CD4/CD8，确保分析的是真正的T细胞群；
• **结果分析：**使用flow软件计算“分裂指数”、“增殖指数”更准确。
  

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参考资料推荐

• 参考Protocol
  
  • Protocol Exchange (Nature) - MSC suppression of T cell proliferation
  • Zoso, A. et al. Human MSC immunosuppressive assay. 2014.
    
• 经典文献
  
  • Le Blanc, K., & Ringdén, O. (2005). Immunomodulation by mesenchymal stem cells and clinical experience. J Intern Med.
  • Glennie, S. et al. (2005). Bone marrow mesenchymal stem cells inhibit T-cell proliferation and function. Blood.
    
• 相关产品说明书
  
  • Thermo Fisher CFSE染料使用说明
  • Dynabeads™ Human T-Activator CD3/CD28 Beads 用户手册
    

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如果你更倾向用CCK-8法、[³H]-thymidine法，或使用ELISA测IL-2/IFN-γ等方式来评估T细胞功能，我也可以再提供对应protocol。
你是否已有某种方法的初稿或实验条件？我可以帮你针对性优化。

世间始终你好

SpringShi 发表于 2025-7-23 13:30
CSFE 流式检测的话直接出百分比吗

很好问题！使用 CFSE（Carboxyfluorescein succinimidyl ester）染料做T细胞增殖检测时，流式细胞仪本身并不会直接输出“增殖百分比”，而是会输出CFSE荧光强度的直方图数据或散点图。你需要通过分析软件（如FlowJo）对数据进行“峰分裂分析”来获得增殖率、分裂指数、增殖指数等定量结果。

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简单流程说明：流式仪与CFSE分析一、流式仪输出的是什么？

• CFSE荧光强度直方图（FITC通道）
  
  
  • 未分裂细胞：高荧光（CFSE原始峰）
    
  • 每次分裂：CFSE荧光强度减半 → 出现多个分裂峰
    
  • 所有细胞的分裂情况会叠加在一个直方图中
    
    

二、如何得出“增殖百分比”？通过流式软件（如FlowJo）分析分裂峰即可得到如下关键指标：
指标名称含义是否反映“百分比”
%Divided（或 %Proliferated）有发生分裂的细胞占总细胞百分比（你要的“增殖百分比”）
Proliferation Index所有细胞的平均分裂次数（仅分裂细胞）（非直接百分比）
Division Index所有细胞（包括未分裂的）平均分裂次数

Precursor Frequency假设从多少个起始细胞分裂出当前群体

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举个例子（FlowJo中）：你看到的CFSE染色图像是这样的：
|←未分裂峰（高荧光）|←1次分裂峰|←2次|←3次|……分析结果可能显示如下：

• Total events: 10,000
  
• %Divided（即增殖率）= 62.5%
  
• Proliferation index = 2.8
  
• Division index = 1.75
  
  

那么你报告中“MSC抑制T细胞增殖率”就可以根据这个 %Divided 去算抑制率了。

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最关键的一句总结：

CFSE流式检测需要通过分析软件（如FlowJo）的“Proliferation Platform”功能来分析“分裂峰”，从而得到 T 细胞的“增殖百分比”这一关键数据。

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逸清草堂

世间始终你好 发表于 2025-7-23 13:19
你说的“MSC检验T细胞增殖抑制率”，通常是在免疫学和细胞治疗领域里用来评估间充质干细胞（MSC，Mesenchym ...

哪家的AI

SpringShi

世间始终你好 发表于 2025-7-23 13:19
你说的“MSC检验T细胞增殖抑制率”，通常是在免疫学和细胞治疗领域里用来评估间充质干细胞（MSC，Mesenchym ...

大佬，MSC：PBMC 比值根据具体产品筛选还是有个推荐值？

SpringShi

世间始终你好 发表于 2025-7-23 13:36
当然可以！下面是一个详细的“MSC抑制T细胞增殖”实验protocol（方案），适用于体外共培养实验，含主要步 ...

CSFE方法比较典型，细节沟通，如何联系呀

SpringShi

世间始终你好 发表于 2025-7-23 13:39
很好问题！使用 CFSE（Carboxyfluorescein succinimidyl ester）染料做T细胞增殖检测时，流式细胞仪本身 ...

100%-增值率，计算结果就是抑制率，这个理解是否正确？

SpringShi

世间始终你好 发表于 2025-7-23 13:19
你说的“MSC检验T细胞增殖抑制率”，通常是在免疫学和细胞治疗领域里用来评估间充质干细胞（MSC，Mesenchym ...

用纯T细胞做实验跟用PBMC 做实验，对最终计算增值率是否有影响？

世间始终你好

SpringShi 发表于 2025-7-23 15:21
CSFE方法比较典型，细节沟通，如何联系呀

18251470560绿泡泡

世间始终你好

逸清草堂 发表于 2025-7-23 14:09
哪家的AI

chatgpt           

逸清草堂

世间始终你好 发表于 2025-7-23 17:06
chatgpt

世间始终你好

SpringShi 发表于 2025-7-23 15:09
大佬，MSC：PBMC 比值根据具体产品筛选还是有个推荐值？

关于 MSCBMC（或MSC:T细胞）共培养的比值选择，在实验设计或产品开发初期，确实是一个关键参数。回答你的问题如下：

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一、是否需要根据具体产品筛选？答：需要根据具体MSC来源、用途和细胞状态进行优化筛选。不同来源（脐带、骨髓、脂肪等）、不同状态（新鲜、冻存）、不同培养条件下的MSC，免疫抑制能力可能差异很大。因此，初次实验建议做“比值梯度筛选”。

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二、有没有常用推荐比值范围？有！以下是文献和行业内广泛使用的推荐比值，你可以从这些比值中选择几个进行筛选：MSC : PBMC（或T细胞）用途特点
1:1强效抑制，基础检测抑制明显，接近最大抑制能力
1:2常用筛选起点既有代表性，又节省MSC
1:4 – 1:5接近生理水平常用于功能界限判断
1:10 – 1:20临床相关剂量反映抑制弱，模拟较低剂量场景
1:40 – 1:100放行/敏感性试验对比敏感性、质量一致性

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常见实践建议：

• 药效或机制研究：用 1:1、1:2、1:5 三个梯度；
  
• 临床前研究或放行标准：1:5、1:10 是主流；
  
• 灵敏度窗口验证：加上 1:20 或更稀释比值；
  
• 质量控制建立时：建议固定1~2个比值用于批间一致性比对。
  
  

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三、文献支持（示例）

• Le Blanc et al., Blood, 2003
  
  
  • MSC:T = 1:1、1:2、1:4、1:8，用³H-thymidine测T细胞抑制；
    
    
• Glennie et al., Blood, 2005
  
  
  • 使用1:1~1:10梯度分析MSC免疫调节功能；
    
    
• 工业标准推荐（如FDA IND指导会议纪要）
  
  
  • 建议以1:5 或 1:10为最低检测比值，以体现产品放行敏感性。
    
    

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总结建议：

建议采用 3~4 个比值做梯度共培养试验：1:1、1:2、1:5、1:10。
后续可根据结果决定用于常规检测的“最敏感窗口比值”作为产品放行或批间比较用点。

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如你需要，我可以帮你设计一套筛选实验方案，包括：

• 比值设定
  
• 分析指标选择（增殖率/IL-2分泌等）
  
• 推荐的批间评估标准设定建议
  
  

世间始终你好

SpringShi 发表于 2025-7-23 15:28
100%-增值率，计算结果就是抑制率，这个理解是否正确？

你的理解基本正确，但要稍微精确一点。

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标准说法：

抑制率（%） = [无MSC刺激组的增殖率 − MSC共培养组的增殖率] ÷ 无MSC刺激组的增殖率 × 100%

也就是：
抑制率=(1−MSC组增殖率阳性对照组增殖率)×100%\text{抑制率} = \left(1 - \frac{\text{MSC组增殖率}}{\text{阳性对照组增殖率}} \right) \times 100\%

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回答你的问题：

你说的“100% - 增殖率 = 抑制率”这个说法 只有在以“无MSC组”为100%标准时才成立，并且前提是你把无MSC组的增殖率作为参考基线（阳性对照），所有MSC组的增殖率都是相对它归一化的。

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举个例子帮助你区分：组别CFSE增殖峰分析结果（%Divided）备注
T细胞 + CD3/CD28（无MSC）80%阳性对照（100%参考）
T细胞 + MSC（1:1）40%抑制一半
T细胞 + MSC（1:5）60%抑制较少计算：

• MSC（1:1）抑制率 = (1 - 40% ÷ 80%) × 100% = 50%
  
• MSC（1:5）抑制率 = (1 - 60% ÷ 80%) × 100% = 25%
  
  

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如果你直接写：

抑制率 = 100% - MSC共培养组的增殖率（如40%）= 60%

这个逻辑前提是你默认“无MSC时为100%”，且各组是做了归一化对比，否则就会出错。

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正确用法建议你在报告中写清楚：

“增殖率为CFSE分析得到的%Divided值，抑制率计算以阳性对照组增殖率为基准归一化后进行。”

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世间始终你好

SpringShi 发表于 2025-7-23 15:29
用纯T细胞做实验跟用PBMC 做实验，对最终计算增值率是否有影响？

非常好的问题！

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简要回答：是的，用纯T细胞 vs 用PBMC 进行MSC共培养实验，对最终计算的“增殖率”（特别是CFSE法中的 %Divided）会有明显影响，从而影响你对MSC抑制能力的评估结果。

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主要区别说明：项目用纯T细胞（CD3⁺）用PBMC（混合细胞群）
细胞类型组成全部为T细胞含T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞等
刺激应答一致性更一致，响应强各类细胞响应不同，T细胞比例不固定
背景干扰少（MSC主要作用于T）有其他细胞影响，如单核细胞可释放干扰因子
流式门控清晰度明确CD3⁺群分析CFSE即可需做CD3/CD4/CD8染色区分T细胞分析
MSC抑制效果评估更敏感、准确反映MSC对T细胞的直接抑制结果更复杂，体现的是对免疫群体的总调节作用
用于产品放行或机制研究更推荐可用于“真实免疫环境”模拟，但易受批间波动影响

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举例说明：假设你用 PBMC 做实验，CFSE阳性细胞中只有一部分是T细胞，其它如B细胞、单核细胞也会有弱应答或背景分裂，甚至不响应。
如果你没有染CD3进行门控分析，你看到的“%Divided”就是混杂的数据——

实际的T细胞增殖可能被“非增殖性细胞稀释”，低估MSC的真实抑制能力。

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推荐策略：实验目的建议用法
机制研究/放行测试用纯化CD3⁺ T细胞，结果更稳定、更明确
模拟真实免疫环境 用PBMC，但必须联合CD3（或CD4/CD8）门控分析
初期筛选或产品比较可PBMC + 染CD3分析，后续建议用纯T细胞验证敏感性

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对“增殖率”计算的直接影响：

• 纯T细胞： 流式图中的CFSE分裂峰清晰，%Divided 准确代表T细胞增殖 → 抑制率计算准确；
  
• PBMC（未门控）： CFSE总体强度变化反映的是混合细胞中所有细胞的分裂情况 → %Divided 偏低或模糊，不建议直接用于定量评估。
  
  

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建议你注意：

如果你用PBMC做实验，一定要做CD3/CD4/CD8染色，用CD3⁺CFSE⁺门控区来分析%Divided，否则无法正确计算T细胞增殖率。

SpringShi

感谢这个平台，可以碰到专业人士，

陈平安1

世间始终你好 发表于 2025-7-23 13:19
你说的“MSC检验T细胞增殖抑制率”，通常是在免疫学和细胞治疗领域里用来评估间充质干细胞（MSC，Mesenchym ...

我去，AI咋下载的，我当初都是自己摸索的实验，这AI写的大差不差了，但具体的还得去做一遍的
大佬，教我怎么下载ChatGPT

世间始终你好

陈平安1 发表于 2025-7-28 13:39
我去，AI咋下载的，我当初都是自己摸索的实验，这AI写的大差不差了，但具体的还得去做一遍的
大佬，教我 ...

得弄个梯子，再注册个谷歌邮箱