微生物限度检查平皿法使用2ml供试液

种地者

想和各位同仁探讨一个问题：用平皿法进行微生物限度检查，使用1：20的供试液，加2ml至直径为120mm的平皿中，再加入30~35ml培养基。这种操作是否可行?个人觉得这样操作，即通过加大稀释倍数降低了抑菌性，同时也保证了供试品的检验量。

世间始终你好

结论先说：可以做，但这是“非典型/超出药典默认条件”的做法，必须做方法学适用性验证（抑菌性中和/稀释验证+回收率对比）并在SOP里明确理由与计算方式。只要验证通过、计算换算正确、平皿几何和琼脂深度匹配，就能作为合规的企业标准化方法使用。

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可行性与注意点

• 接种体积 2 mL 是否允许？
  
  

• 多数药典（如 ChP/USP/EP 的平皿倒平板法）示例为“每皿 1 mL 接种 + 15–20 mL 琼脂（90–100 mm 皿）”。
  
• 你用 120 mm 大平皿 + 30–35 mL 琼脂 时，增大到 2 mL 接种是可操作的（皿更大、琼脂更厚、扩散不拥挤），但属于偏离范例条件，因此必须以适用性验证证明不影响回收（见第4点）。
  
  

• 抑菌性处理的逻辑
  
  

• 你先做 1:20 供试液 再“2 mL 倒平板”，等于通过前稀释降低了抑菌性，同时维持一定“等效检验量”，这是合乎思路的。
  
• 也可并用中和剂/去除剂（如卵磷脂/吐温、硫代硫酸钠、组氨酸等，视抑菌成分而定）提高回收稳定性。若抑菌性仍明显，优先考虑膜过滤法。
  
  

• 等效检验量与换算（很关键，写进SOP）
  
  

• 你方案：1:20 稀释 × 加样 2 mL ⇒ 等效于原液 0.1 mL/皿（2 mL ÷ 20 = 0.1 mL）。
  
• 这与常见“1:10 稀释 × 加样 1 mL ⇒ 0.1 mL/皿”在等效检验量上一致。
  
• 因此，结果换算：原样品 CFU/mL =（平皿计数合计 / 加样等效体积）× 稀释倍数。以你法为例：若两皿合计计数为 N，等效检验体积 0.1 mL/皿 × 2 皿 = 0.2 mL，且起始稀释 1:20，则
  CFU/mL 原样=N0.2×20=100×N\text{CFU/mL 原样} = \frac{N}{0.2}\times 20 = 100\times N
  

（固体样/按 g 计亦同理，按制备初悬液与加样量折算。）

• 必须完成的方法学适用性验证（抑菌性/回收）
  
  

• 选择规定菌株（TAMC/TYMC 对应的需氧菌/霉酵母）做回收对比：
  
  
  • 阳性对照：不含样品，仅接种约 50–100 CFU（或药典建议的接种量）。
    
  • 供试：你的“1:20 稀释 + 2 mL + 30–35 mL 琼脂（45±1 °C）”全流程。
    
    
• 计算回收率，通常不得低于 70%（依所用法典与指南要求执行你们的判定值）。
  
• 同时做阴性对照（无生长）以证无外源污染。
  
• 若回收不足：优先调整中和体系或改用膜过滤。
  
  

• 120 mm 平皿与琼脂体积
  
  

• 120 mm 皿倒 30–35 mL 可以得到约 3–4 mm 琼脂层，合理。
  
• 琼脂温度控制在 45 ± 1 °C 再倒板并温和混匀，避免热杀灭或气泡夹带。
  
• 仍建议每个稀释做至少两皿，并保持可计数范围（一般 30–300 CFU/皿）。
  
  

• 合规性与文件化
  
  

• 因为接种体积偏离“1 mL/皿”范式，请在SOP/方法验证报告中清晰记录：
  
  
  • 采用 120 mm 皿与 30–35 mL 琼脂的几何与体积依据；
    
  • 选择“2 mL 接种”的风险评估与科学合理性；
    
  • 抑菌性评估、中和体系、回收率数据与判定标准；
    
  • 结果换算公式与实例；
    
  • 适用范围（哪类样品用此法；遇强抑菌样改膜滤）。
    
    

• 若用于放行判定
  
  

• 确保此法在检出限上满足你们的限度要求（例如限度是 NMT 100 CFU/mL，你的等效检验量、稀释和加样安排应保证在该数量级仍能得到“可计数/可检出”的统计把握度）。
  
  

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小结你的方案（1:20 稀释，120 mm 皿中加入 2 mL 供试液，再倒入 30–35 mL 琼脂）在技术上是可行的，也确实能通过稀释降低抑菌性、同时保持等效检验量。但由于其偏离药典常用的 1 mL/皿范式，务必通过方法学适用性验证（含回收率、抑菌性中和/稀释的证明）并将换算关系与适用范围写入SOP。若验证显示仍受抑制或回收不足，优先切换膜过滤法或增强中和体系。

游侠某

理论上可以，但偏离了药典要求的规定，需要做方法开发和验证，增加了工作量，如果是对某个物料首次进行开发和验证那么工作量基本没有增加，之后一直沿用这个方法就可以，如果开发和验证已经用的是药典要求的1：10稀释取1ml接种，那就没必要了，增加工作量

种地者

世间始终你好 发表于 2025-8-19 10:02
结论先说：可以做，但这是“非典型/超出药典默认条件”的做法，必须做方法学适用性验证（抑菌性中和/稀释验 ...

感谢回复分析

咒逐

培养基稀释法有两种，1增加单次检测用培养基，2，多平皿合并计数，

2010版药典有具体内容，后面版本删了，但是仍有提及，

“供试液接种后，按下列“微生物回收”规定的方法进行微生物计数。若试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值小于菌液对照组菌落数值的50%，可采用下述方法消除供试品的抑菌活性。
　　(1)增加稀释液或培养基体积。”

安安份份的小尘1

根据现行药典及微生物限度检查法要求，您提出的操作（使用1:20供试液加2ml至120mm平皿，再加入30~35ml培养基）存在以下关键合规性风险与改进建议：

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一、操作风险分析

  1. 检验量不达标：

若采用1:20供试液2ml，实际检验量仅对应原样品0.1g或0.1ml（稀释液体积=2ml×(1/20)=0.1ml）, 低于《中国药典》微生物限度检查的常规检验量要求（通常为10g或10ml）



。

例外：若样品属于“贵重药品”或“微量包装药品”，需在申报资料中说明检验量合理性与风险（如提供抽样代表性证据）

。

  2. 培养基体积超限：

药典规定平皿法培养基用量通常为15~20ml（如直径90mm平皿），而您使用30~35ml培养基（适用于更大平皿如150mm），可能导致琼脂凝固不均或菌落分布异常，需验证培养基厚度对菌落计数的可靠性



。

  3. 稀释倍数合理性存疑：

虽然1:20稀释可降低抑菌性，但稀释倍数过高可能导致微生物检出限不足（如实际微生物负载过低时出现假阴性）。根据验证要求，应通过回收率试验证明该方法能有效检出目标微生物（菌落回收率需≥70%）



。

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二、合规解决方案

1. 调整检验量与稀释逻辑

  • 若原样检验量为10g或10ml，建议采用1:10供试液10ml（即稀释后供试液量=10ml，对应原样1g或1ml）



。

  • 若确需高稀释倍数（如强抑菌性样品），需增加平行测试平皿数量（例如：使用多个平皿叠加检验量至10g或10ml），并通过验证数据支持此操作。

2. 规范培养基体积与操作

  • 使用直径90mm平皿并控制培养基体积15~20ml（倾注法）或10~15ml（涂布法），以符合药典常规操作方法。

  • 120mm平皿的合规性验证：若使用大平皿，需证明其菌落计数结果与小规格平皿等效（如通过菌落分布均匀性测试）。

3. 强制方法适用性验证

  • 回收率验证：采用平皿法或薄膜过滤法，向最低稀释级供试液中添加50~100cfu试验菌（如金黄色葡萄球菌、白色念珠菌），验证回收率≥70%。

  • 抑菌性消除验证：对比不同稀释倍数下菌落生长情况（例如：1:10 vs. 1:20稀释），确认高倍数稀释可消除假阴性风险。

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三、操作示例（合规方案）

以检验量10g样品为例：

  1. 供试液配制：

将10g样品稀释至100ml（即1:10供试液）。

  2. 平皿法操作：

      • 取10ml供试液（原样检验量=1g）分注至2个平皿（每皿5ml，对应总检验量10ml×1/10=1g）。

      • 每皿倾注15~20ml培养基（温度≤45℃）。

  3. 验证补充：

      • 若检出微生物接近限值或存在抑菌性，建议改用薄膜过滤法（如全量过滤+冲洗液处理）。

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四、风险警示

未按药典要求执行可能导致以下后果：

  • 检验结果无效：超稀释或检验量不足时，审评机构可能拒收数据或要求重检。

  • 方法偏差记录：若偏离标准操作，需在原始记录中注明原因并提供风险评估（如紧急检测条件下的临时调整）。

结论：当前方案需调整检验量与稀释逻辑，并通过严格方法验证支持操作合规性。建议优先遵循药典规定或与属地药检所沟通确认替代方案可行性。

Rabbi

世间始终你好 发表于 2025-8-19 10:02
结论先说：可以做，但这是“非典型/超出药典默认条件”的做法，必须做方法学适用性验证（抑菌性中和/稀释验 ...

这不是5N吗，咋算得100N

世间始终你好

Rabbi 发表于 2025-8-26 17:08
这不是5N吗，咋算得100N

100*N