水蛭凝血酶检测

沐～i

想问下水蛭活性检测：配制0.5%牛纤维蛋白原的溶液需要怎么配制呢？它的规格是86mg/支。刚开始凝固的太快，后面重新稀释了下牛纤维蛋白原，就一直不凝固了

世间始终你好

下面给你一份可直接操作的配制、使用和排查指南（中文），包含逐步计算、配方、注意事项和常见问题的解决办法。先给结论性的计算结果，然后是详细操作与故障排查。

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关键计算（逐位算，确保不出错）目标：0.5% w/v（即 0.5 g/100 mL = 5 mg/mL）。

• 0.5% = 0.5 g / 100 mL = 500 mg / 100 mL = 5 mg/mL。
• 每支规格：86 mg/支。
• 要得到 0.5%（5 mg/mL），1 支可配的体积 = 86 mg ÷ 5 (mg/mL) = 17.2 mL。
  （算式：86 ÷ 5 = 17.2）
  

举例常见用量换算：

• 要配 10 mL 0.5%，需要 5 mg/mL × 10 mL = 50 mg。
  50 mg 占 86 mg 的比例 = 50 ÷ 86 ≈ 0.5814 支（即把一支粉溶解后取 58% 体积，或把整支溶于 17.2 mL 后按比例取 10 mL）。
• 要配 5 mL 0.5%，需要 25 mg（25 ÷ 86 ≈ 0.2907 支）。
  

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建议配制方法（实验室级、安全、可重复）所需试剂/耗材

• 牛纤维蛋白原（你的是 86 mg/支，假设为冻干粉）。
• 生理盐水或 PBS（pH 7.2–7.6）或含缓冲的 Tris-buffered saline（常用 PBS）。
• 低蛋白吸附离心管或瓶（避免吸附损失）。
• 旋转混匀器或温和搅拌器；冰上操作或 4°C 过夜帮助溶解。
• （若用于凝固实验）活性凝血酶（thrombin）、CaCl₂ 溶液（例如 1 M stock，按需稀释）。
• 0.22 µm 低蛋白结合过滤器（若需要无菌），注意有些滤器会吸附纤维蛋白原——优先用低吸附材料（PVDF/低蛋白性过滤器）并预润湿。
• 冰或 4°C 冰箱、移液器、无菌吸头等。
  

标准配制步骤（以整支溶于 17.2 mL 得到 0.5% 为例）

• 在生物安全柜中准备并灭菌所需容器与缓冲液（无菌 PBS，室温或4°C）。
• 将 86 mg 冻干粉从瓶中取出，轻敲瓶壁使粉松散。
• 加入约 80% 目标体积（即先加 ~13.8 mL PBS，17.2 × 0.8 ≈ 13.8 mL）以减少起泡。
• 轻轻颠倒或在旋转混匀器上缓慢滚动（避免剧烈漩涡/气泡）直至溶解。可放 4°C 过夜帮助完全溶解。切忌剧烈振荡或用超声（会使变性/聚集）。
• 溶解后补加 PBS 到最终体积 17.2 mL。轻轻混匀。
• 若需要无菌，使用低蛋白吸附的 0.22 µm 滤器过滤（注意可能有少量吸附损失，必要时校正浓度）。或者分装在无菌管中离心去颗粒后保存。
• 分装为小份（建议 0.5–1 mL/管）并立即放 -80°C 长期保存，短期可 4°C 保存 ≤ 1–3 天。尽量避免反复冻融。
  

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用于凝固（形成纤维蛋白凝块）——必要的添加物与浓度重要：纤维蛋白原本身不会自发“凝固”成为网状凝块，必须加凝血酶（thrombin）并且通常需要 Ca2+。
若你之前“刚开始凝固太快”或“后来不凝固”，往往是因为 thrombin、Ca2+ 的用量、活性、温度或 pH 问题。
一个常见起始配方（体外凝块形成）：

• 纤维蛋白原：0.5%（5 mg/mL）（你已配好）。
• 凝血酶：初始建议 0.5–2 U/mL（国际单位／mL） 的范围做梯度试验；凝块速度与浓度正相关。
• CaCl₂：最终体系中 2.5–10 mM 常见，典型用 5 mM。
• 反应温度：室温到 37°C，37°C 会明显加快凝固；室温或 4°C 则慢。
  

操作建议（混合顺序）

• 在冰上或低温下把纤维蛋白原和 CaCl₂、缓冲液调好（若想慢些，保持冰上）。
• 将 thrombin 用小体积加入到纤维蛋白原溶液中，轻轻混匀并迅速转移到实验位点（如孔板/管），启动计时。
• 若想减慢凝固速度：降低 thrombin 用量（例如 0.1–0.5 U/mL），或把体系保持在较低温度（室温或冰上），或先将 thrombin 用冰冷缓冲稀释后再加入。
• 若想加速凝固：提高 thrombin（例如 2–5 U/mL）或升温至 37°C / 增加 Ca2+。
  

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针对你遇到的问题 —— 故障排查与解决建议

• “刚开始凝固太快”
  
  • 可能原因：thrombin 浓度太高、操作温度高（靠近 37°C）、或者你使用了含有活性凝血酶的污染/残留。
  • 解决：把 thrombin 从高到低做梯度（例如 5 → 2 → 1 → 0.5 → 0.1 U/mL），或在冰上混合并在室温下观察；或先把纤维蛋白原和 Ca2+冷却后再加入少量 thrombin。
    
• “后来稀释了下纤维蛋白原，一直不凝固”
  
  • 可能原因：
    
    • thrombin 活性不足或失活（过期、反复冻融、储存不当）。
    • 缺少 Ca2+（或 Ca2+ 被 EDTA 等螯合剂污染）。
    • 纤维蛋白原被降解或变性（溶解时过热、长时间 >4°C 保存或多次冻融）。
    • pH 偏离（应在 7.0–7.6 左右）。
    • 体系被蛋白酶/纤溶酶（plasmin）污染，导致不形成或形成后被溶解。
      
  • 检查/解决：
    
    • 用已知活性的 thrombin 做阳性对照（用标准纤维蛋白原配对照体系验证 thrombin 是否能使正常纤维蛋白原凝固）。
    • 确认 CaCl2 已添加且无螯合剂存在。
    • 检查 pH 与离子强度（用 PBS）。
    • 用新开封或正确保存的试剂重试；避免反复冻融。
    • 若怀疑纤溶，加入抑纤溶剂（如 aprotinin/ε-ACA）做对照看是否恢复凝块（注意安全与合规）。
      
• 滤器吸附/蛋白丢失
  
  • 有时你过滤或稀释后浓度下降导致无法凝固。用低吸附材料或补偿吸附损失（测定实际浓度或用整支溶于精确体积后按比例取用）。
    
• 温度与时间
  
  • 在 37°C 下凝块很快（秒到分钟），室温慢很多。按你实验设计选择合适温度。
    

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质量与保存建议

• 溶液短期（当天）可 4°C 保存，但最好当天用完；长期保存分装并 -80°C 冷冻（单次使用量分装，避免冻融）。
• 记录批号、溶解体积、配制日期、操作者。
• 溶解后如出现浑浊/颗粒，离心（低速）或弃用并重新配制。
• 血源性产品要遵守生物安全（BSL-2）与相关血源产品管理规定，戴手套、眼面防护，做好废物处置。
  

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小结（操作上可立即采纳的快捷步骤）

• 若你已有 86 mg/支：溶于 17.2 mL PBS 得到 0.5%（5 mg/mL）。
• 溶解宜在 4°C、轻柔滚动或过夜；避免剧烈振荡。
• 若需凝固，加入 thrombin（先从 0.5–1 U/mL 试起） + CaCl₂（终浓 5 mM 作为起点），并按需调整温度与酶量。
• 如果“太快”→ 降低 thrombin 或降温；如果“不凝”→ 检查 thrombin 活性、Ca2+、pH、蛋白是否被降解或稀释过头。