同型半胱氨酸测定试剂盒（酶法）综述文件

蒲香01

同型半胱氨酸测定试剂盒（酶法）

综述资料

1、产品的预期用途：

1.1产品的预期用途

同型半胱氨酸测定试剂盒（酶法）用于定量测定人体血清或血浆中同型半胱氨酸的含量。

1.2与预期用途相关的临床适应症背景情况

　同型半胱氨酸（homocysteine，HCY）又称高半胱氨酸，是蛋氨酸去甲基后形成的一种含硫氨基酸，属于蛋氨酸循环的中间产物。有关其代谢紊乱的报道最早来源于先天性胱硫醚合成酶缺乏导致出现同型半胱氨酸尿患者的观察。此后，又相继发现其他几种参与HCY代谢的酶或辅酶改变所引起的代谢紊乱。近几年来，随着测定技术方法的改进，已经能够对正常人血浆中以各种形式存在的HCY进行测定，并且发现在心、脑及外周血管疾病、慢性肾功能不全、牛皮癣、维生素B12缺乏等疾病的患者中存在HCY的代谢紊乱。对同型半胱氨酸的研究始于20世纪70年代，1969年首次提出高同型半胱氨酸血症可致动脉粥样硬化并可形成血栓后，人们逐渐发现人体血清中同型半胱氨酸的含量与冠心病、脑血管疾病、外周血管疾病和静脉血栓的发生和发展有着密切的关系，而且随着同型半胱氨酸含量的增加发生血管疾病的危险也呈递增趋势。

高同型半胱氨酸通过氧自由基介导引起血管内皮损伤，不同浓度的血清Hcy还可通过抑制内皮细胞DNA的合成，影响内皮功能及细胞形态改变，并促使血管平滑肌细胞增殖，导致动脉粥样硬化。血清Hcy可使血小板受损，使血小板的黏附性和聚集性增加。血清HCy尚能改变花生四烯酸代谢，使血栓素A2合成增加，血栓素A2具有收缩血管和促血小板聚集的作用。血清Hcy还通过抑制凝血酶调节蛋白在内皮细胞表面的表达及活性，进一步抑制蛋白C的激活，影响凝血酶的灭活。血清Hcy还能增加组织因子的活性，激活凝血酶，导致血管系统的血栓少形成。

目前越来越多的资料显示 Hcy与脑血管病有着紧密的联系。甚至有人认为Hcy水平升高是脑血管病的一项独立危险因素和重要危险因子。研究分析表明，随着血浆Hcy水平的增高，患缺血性脑血管病的相对危险度逐渐增加，与非Hcy患者相比，Hcy患者患缺血性脑血管病相对危险度增加。此外，研究还发现，不论是缺血性脑血管病患者，还是脑梗死和TIA患者，其血浆Hcy水平均高于对照组，提示Hcy水平升高可能与缺血性脑血管病的发病密切相关。脑梗死与TIA患者血浆Hcy水平相比无显著性差异，表明Hcy水平与缺血性脑血管病的类型可能无关。

1.3相关的临床和实验室诊断方法

目前有关Hcy测定方法有气相色谱－质谱联用法、氨基酸分析仪、高效液相色谱法、全自动荧光偏振免疫法、高效毛细管电泳法和酶法等。

气相色谱－质谱联用法：所用的仪器为气相色谱-质谱仪，标本的处理过程包括:先加入三种内标:同型胱氨酸，胱氨酸和L－（甲基－2H3）蛋氨酸，然后加EDTA-Na2和β－巯基乙醇100℃、15min，再以磺基水杨酸沉淀蛋白，上清液用离子交换柱预处理，氮气吹干后，用水重新溶解，进行衍生处理后上样.气相色谱仪进样温度250℃，毛细血管柱箱温度180℃，以8℃ /min速度升温至276℃，柱前端压力为26psi，以保留时间和质谱进行定性和定量。气相色谱－质谱联用法操作十分复杂，耗时长，仪器设备要求高，现除了在某些专门的实验室进行测定外，普及很困难。

氨基酸分析仪法和高效液相色谱法：氨基酸分析仪和高效液相色谱法(HPLC)这两种方法都属色谱分离技术，HPLC由于其分离的高效率和检测方式灵敏而更常用一些。HPLC根据所用的色谱柱(反相柱或离子交换柱)、衍生方式(柱前或柱后衍生)、检测方式(紫外或荧光)又分为多种测定方法。其中以Fiskerstrand等报道的方法较有代表性。血液标本以EDTA-Na2抗凝，0℃～4℃，2000g离心5min，磺基水杨酸沉淀蛋白质，上清液再与NaBH4溶液反应，还原二硫键，衍生化试剂为0.025mol/L的Monobromobimane，反应3min后以冰醋酸终止反应。20ul衍生化后的样本进入一根150mm X 4.6mm ODS柱。色谱柱预先以pH3.5的硝酸铵缓冲液平衡，用含有乙腈的流动相进行梯度洗脱，用荧光检测器激发波长365nm，发射波长475nm检测。这两种方法耗时长且不适宜大规模自动化的测定。全自动荧光偏振免疫法和高效毛细管电泳法等方法也都存在类似的缺点。酶法测定血清同型半胱氨酸反应原理：基于小分了捕获技术SMT的S－腺苷同型半胱氨酸的方法，这种方法测定迅速、准确，适合医院内大规模测定样本。

2、产品描述：

2.1技术原理：

同型半胱氨酸被转化为游离型后，通过与共价底物反应，同时产生腺苷。腺苷立即水解成氨和次黄嘌呤，氨在谷氨酸脱氢酶的作用下，使β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原性（NADH）转化为NAD+，样本中的同型半胱氨酸的浓度与NADH的变化成正比。

2.2 主要原材料的选择及制备方法

主要原材料均购自Sigma公司、Amresco公司等。具体如下：

主要原材料	来    源	制备方法
Tris	Amresco公司	直接使用，无需制备
HCl	北京化工厂	直接使用，无需制备
S-腺苷甲硫氨酸盐	Sigma公司	直接使用，无需制备
NADH	Amano公司	直接使用，无需制备
TCEP	Sigma公司	直接使用，无需制备
α-酮戊二酸	Amresco公司	直接使用，无需制备
修饰化HCY甲基转移酶	ASAHI公司	直接使用，无需制备
GLDH	TOYOBO公司	直接使用，无需制备
修饰化S-腺苷同型半胱氨酸 水解酶	ASAHI公司	直接使用，无需制备
腺苷脱氨酶	Sigma公司	直接使用，无需制备
BSA	Roche公司	直接使用，无需制备
纯化水	北京中关村生命科学园孵化器公司	直接使用，无需制备

2.3主要生产工艺过程

主要的生产工艺过程为试剂的称量、溶解配制、分装、组装。生产流程详见附件1。

2.4校准品、质控品的制备及溯源

根据目前生化体外诊断试剂的发展趋势及用户的要求，试剂生产商应尽可能提供与试剂配套的校准品，并对校准品进行溯源性研究。本公司根据Hcy试剂的实际情况，对Hcy校准品的溯源、制备、赋值进行了研究。

2.4.1 Hcy校准品的溯源

由于目前尚没有这一物质的国家标准物质及标准品，本公司采用Sigma-Aldrich公司生产的超纯物质Hcy配制校准品。

2.4.2基础液的制备

称取超纯三羟甲基氨基甲烷12.1g，优级纯NaCl 9g，人白蛋白40g溶于500ml纯化水中，将溶液倒入1000ml的容量瓶中，反复冲洗烧杯6次，洗液加入容量瓶中，在加入0.5‰（W/V）的抑菌剂，用1N盐酸调pH至7.40±0.10（25℃），定容，经0.45um滤膜过滤除菌后混合，分装为50ml/瓶，-20℃冰冻存放。

2.4.3 Hcy校准品的生产

根据生产量的要求，于2～8℃复融合适量的基础液，加入容量瓶中至总体积的60%，依据Sigma-Aldrich公司提供的分析报告资料，移取一定量的hcy，以基础液溶解并转移至容量瓶中，以基础液清洗小烧杯三遍并转移至容量瓶中，用基础液定容至总体积。

2.4.4 Hcy校准品的赋值

鉴于Hcy校准品没有国家标准物质，也没有可供参照的有证参考物质，本公司采用公认质量最好的Sigma-Aldrich公司的原料，以Sigma-Aldrich公司提供的数据为依据，确定Hcy校准品的含量。该校准品与本公司生产的Hcy试剂配套使用，并通过测定质控品或与同行公司的产品进行比对实验进行验证。根据Hcy加入量和校准品最终体积确定校准品的含量。

                    Hcy超纯物质加入量

校准品的含量=   

                        校准品总体积

2.4.5 Hcy校准品赋值的验证

以工作校准品为样本，在本公司实验室内，使用已注册的两家公司同类试剂、仪器及程序各组成一套测定系统，测定产品校准品浓度（平均测定十五次），去掉±2SD外的数据，剩余数据取平均值，计算各不同浓度校准品的准确度，各校准品的准确度均符合要求，测定值在可接受范围内；说明配制的校准品数值是准确的。研发完成后以本公司制备的校准品、试剂组成一个测试系统，与已取得注册证的Hcy测定试剂进行比对试验，两种试剂同时测定40个标本，进行数据分析，相关系数r≥0.975,每个浓度点的相对偏差R≤20%。

3、关于生物安全性方面的说明：

同型半胱氨酸测定试剂盒（酶法）所使用的原料主要是普通的化学试剂，没有易燃、易爆、有毒、有害物品，并且没有污染性，对人体及周围环境没有任何的危害。其中的生物制品均经过纯化和灭活处理，不含有任何传染性和致病性成分，因此在产品运输、使用过程中对使用者和环境是安全的，不会有负面作用。

本产品外观形式为一长方体硬质纸板盒，盒内包括产品使用说明书、R1试剂、R2试剂、校准品，提供给用户的产品可直接使用，无须再做任何的处理，不会发生污染等现象；本产品为一次性使用品，用后即可整体销毁，卫生安全性很好，因此对使用者无任何潜在危害。

本产品需2～8℃避光、干燥处贮存；温度超出允许范围，如低于2℃甚至冰冻条件或长期高于8℃（置于热源附近或夏季高温）均可能使试剂性能下降；

强光照射或夏季阳光曝晒或潮湿的环境也会使试剂性能下降；

运输不当，如长期超出储存条件下运输或野蛮搬运而致包装破裂也会使试剂失效。

4、产品主要研究结果的总结和评价

4.1产品主要研究结果的总结

该产品经历了主要原材料的选择及其校准品、质控品、产品质量标准的研究确定、生产工艺研究及反应体系的建立、产品稳定性研究和临床试验等几个阶段。

首先进行的是原材料的选择和校准品、质控品的确定。同时采购准备了各种规格的加样器、冰箱、生化分析仪、电脑、试剂瓶等仪器设备和辅助材料。

产品研制过程中，我们查阅了国内外相关文献，先确定了产品采用的方法原理，然后确定主要生产工艺，建立反应体系，对反应体系组成、标本、试剂用量及体系的反应条件进行了研究。研制过程中，重点对关键原材料进行了实验选择，以保证产品测定结果的准确性和产品稳定性。

我们进行了小批量产品的试生产工作，并对试产品进行了全面的质量考核，研究包括剂量反应曲线、分析灵敏度、精密度、准确性、质控测定值等，同时进行了临床研究，结合临床以客观的态度对试剂作评价。

4.2对该产品的评价

经过反复实验和测试，我公司研制的产品灵敏度高，精密度好，线性范围宽，特异性好，不受血清其他成分的干扰，准确度好，与其他公司产品有良好的相关性；校准品有良好的溯源性，定值可靠，适用于各种不同类型的生化分析仪。空白吸光度、准确性、批内精密性、批间精密性、线性范围、稳定性等指标均满足产品设计要求，能够满足临床使用要求。

整个产品研发与生产过程完全由本公司技术人员独立设计制造完成，掌握了核心技术，具有完全的自主知识产权。我公司研究开发的同型半胱氨酸测定试剂盒（酶法），简便、快速、准确，适合临床大批量标本的检测。

5、其他

目前有关Hcy测定方法有气相色谱－质谱联用法、氨基酸分析仪、高效液相色谱法、全自动荧光偏振免疫法、高效毛细管电泳法和酶法等。气相色谱－质谱联用法操作十分复杂，耗时长，仪器设备要求高，现除了在某些专门的实验室进行测定外，普及很困难。而除了酶法以外的其它几种方法都很难实现快速的大规模测定。酶法具有用时短、测定准确，能自动化且适合大规模测定等优点。

同型半胱氨酸测定试剂盒（酶法）国内外已有产品上市，但仅有少数厂家能够生产，液体试剂很不稳定。本公司的同型半胱氨酸测定试剂盒（酶法）经过研发人员的努力，解决了液体试剂的不稳定问题，可直接使用，对于临床检测非常方便。

同型半胱氨酸测定试剂盒（酶法）测定作为一种新兴的检验方法，不仅准确，而且使用方便，可以同其他常规检测项目一起用全自动生化分析仪进行检测，降低了检测成本，适用于临床推广使用。

本公司的同型半胱氨酸测定试剂盒（酶法），在准确性、重复性、线性范围、稳定性等关键性能指标上均达到国内外同类产品较高质量水平。

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附：参考文献

1.     敖敏高娃，张国庆，韩敏。脑梗死患者血清同型半胱氨酸测定的意义。中国医药指南，2009，7（2）：94－95

2.     高静，董振南，田亚平。酶法测定血清同型半胱氨酸的临床应用研究。中华检验医学杂志，2006，29（3）：199－201

3.     胡红焱，刘建刚。血液同型半胱氨酸的测定方法及临床意义。国外医学临床生物化学与检验学分册，1999，20（6）：254－255

wangyj579

资料很好，学习学习。

oО星辰﹏

谢谢分享              

a881407

谢谢分享   

如意吉祥yqn

资料非常好 ，感谢分享