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一、粒径的影响:根据范第姆特方程,填料的粒径越小,柱效越高。现代HPLC柱普遍使用3μm甚至更小(如1.8μm)的填料。 (1)5μm填料柱:每米理论塔板数约8000-15000 (2)4.5μm填料柱:每米理论塔板数约12000-17000 (3)3.5μm填料柱:每米理论塔板数约15000-18000 (4)3μm填料柱:每米理论塔板数约18000-22000 (5)亚2μm填料柱(用于UPLC):每米理论塔板数可超过25000-30000 二、柱长的影响:理论塔板数与柱长成正比。 (1)一根150mm长的3μm色谱柱,其总理论塔板数可能达到:(18000/m)×0.15m=2700。这远高于2000的标准。 (2)一根250mm长的5μm色谱柱,其总理论塔板数可能达到:(8000/m)×0.25m=2000。这达到2000的标准。 三、综上所述: (1)长柱理论塔板数定不小于2000,若方法开发过程中,主成分理论塔板数小于2000,可选择4.5μm或更小粒径。 (2)常规分析柱理论塔板数可以定不小于1500,若方法开发过程,提高标准为2000,可选择4.5μm或更小粒径。 (3)为节省分析时间,HPLC选择快速分析柱,从专属性、重复性、精密度、耐用性等进行方法验证且验证通过。进行理论塔板数设定时,多数分析人员定“以主成分峰计理论塔板数不低于2000”,这是不合理的,超短柱/快速分析柱理论塔板数计算值在400~900范围内,结合化合物保留时间小、其他峰对其无干扰、拖尾因子,理论塔板数可定不小于800。色谱柱制造技术的发展,应定“不小于1000”。
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