可能的聚集体类型示意图。...

奕安济世生物药

随着寡核苷酸（ASO、siRNA、适配体等）药物在治疗领域的快速发展，对其质量控制与结构稳定性的研究也日益深入。

近期，欧洲寡核苷酸药物联盟 (EPOC) 在《Journal of Pharmaceutical Sciences》上发表了一篇重要综述，系统总结了寡核苷酸药物中高级结构 (HOS)、超分子高级结构 (sHOS)  以及聚集体 (Aggregates)  的评估与表征策略，为行业提供了科学、系统的工作流程与实验建议。

一、什么是HOS、sHOS与聚集体？

1. 高级结构 (HOS)

寡核苷酸不仅具有一级序列结构，还能通过氢键、π-π堆叠等非共价作用形成二级和三级结构，统称为高级结构(HOS) 。

常见的HOS包括：

▪ 双链结构 (如siRNA的A型双链)

▪ 发卡环 (Hairpin loop)

▪ G-四链体 (G-quadruplex)

▪ 三链体 (Triplex)

▪ i-基序 (i-Motif)

2. 超分子高级结构 (sHOS)

当多个HOS通过非共价作用进一步组装，形成有序的多聚体结构 (如二聚体、三聚体等)，即为sHOS。其特点是每个HOS保持结构完整性和独立性。

3. 聚集体 (Aggregates)

聚集体通常是指多个寡核苷酸分子或 (s) HOS无序聚集形成的非特异性、结构不明确的大分子簇，可能影响药物的物理稳定性与制剂工艺。

根据尺寸可分为：

▪ 可见聚集体 (≥ 100 μm)

▪ 亚可见聚集体 (1–100 μm)

▪ 亚微米聚集体 (50–1000 nm)

图1. A) 高级结构 (HOS)；B) 超分子高级结构 (sHOS)；C) 可能的聚集体类型示意图。图中还以A型双链为例，给出了决定寡核苷酸HOS及其稳定性的主要结构和环境因素概览

二、为什么需要评估这些结构？

虽然大多数寡核苷酸药物在常规条件下不会形成非预期的HOS或聚集体，但在特定环境条件 (如高浓度、特定离子强度、极端pH等) 下，这些结构可能形成，并影响：

▪ 纯化工艺收率

▪ 制剂稳定性

▪ 分析方法开发

▪ 冻融或长期储存中的物理稳定性

EPOC调查显示：

▪ 约90%的成员企业认为HOS评估是药物开发中的重要环节

▪ 75%和100%的企业已对ASO和siRNA开展HOS表征实验

▪ 88%的企业未遇到寡核苷酸固有粒子形成问题，但聚集体可能在长期稳定性试验中出现

三、如何系统评估与表征？

1. 针对预期HOS (如siRNA双链) 的表征流程 (Workflow 1)

▪ 理论预测：基于序列与修饰设计，明确预期HOS类型。

▪ 实验验证：在常规分析条件下 (如PBS缓冲液) 进行结构验证。

▪ 稳定性评估：若HOS不稳定或未形成，需在工艺相关条件下重新评估。

▪ 工艺优化：根据结果调整退火、纯化或制剂工艺。

图2. HOS Workflow 1：寡核苷酸治疗药物预期高级结构 (HOS) 的表征

2. 针对非预期 (s) HOS的评估流程 (Workflow 2)

▪ 序列分析：筛查可能形成HOS的序列特征 (如G-rich区域、自互补序列)。

▪ 环境模拟：模拟制剂与工艺条件 (离子强度、浓度、温度等) 进行实验。

▪ 结构确认：使用正交技术确认 (s) HOS是否形成。

▪ 风险评估与优化：评估对工艺与制剂的影响，必要时调整工艺参数。

图3. HOS Workflow 2：寡核苷酸形成非预期（超分子）高级结构（(s)HOS）倾向性的表征

3. 针对聚集体的评估流程 (Workflow 3)

▪ 早期筛查：在制剂开发早期使用DLS等工具进行聚集体风险评估。

▪ 应力试验：开展pH、浓度、冻融、温度等条件研究。

▪ 正交验证：结合多种粒径分析技术进行确认。

▪ 工艺控制：若聚集体形成，优化制剂组成或工艺参数。

图4. 聚集体分析Workflow

四、关键分析技术工具箱

1. HOS表征技术

技术	测量特征	优点	局限性
熔解曲线分析(UV/ECD)	Tm值、热稳定性	简单、低样品量、可获取热力学参数	对HOS类型信息有限
圆二色谱 (ECD)	HOS特征光谱	可区分不同HOS、适用于制剂浓度	定性至半定量，需结合其他技术
尺寸排阻色谱 (SEC-MALS)	尺寸、分子量、分布	可定量、可区分不同HOS	方法建立较耗时，需优化色谱条件
核磁共振(NMR)	精细结构信息、氢键状态	可识别特定氢键模式（如亚氨基质子）	谱图复杂，适用于特征分析

2. 聚集体表征技术

▪ 光阻法/流式成像：用于亚可见粒子 (1–200 μm) 计数。

▪ 动态光散射 (DLS)：快速筛查亚微米级可溶性聚集体。

▪ 纳米粒子追踪分析 (NTA)：粒子粒径与浓度分析。

▪ 共振质量测量 (RMM)：区分粒子类型 (如硅油滴 vs 蛋白聚集体)。

五、EPOC的核心建议

1.早期评估：在药物开发早期即开展HOS与聚集体的风险评估。

2.条件模拟：实验设计需涵盖制剂与工艺相关条件，而非仅常规分析条件。

3.正交验证：结合多种分析技术进行结构确认与稳定性评估。

4.科学决策：根据评估结果科学调整工艺与制剂策略，实现“一次作对” (right-first-time)。

结语

寡核苷酸药物的结构复杂性虽不及蛋白质，但其在特定条件下形成的HOS、sHOS与聚集体仍可能影响药物开发与质量。随着更多寡核苷酸药物进入临床与市场，EPOC提出的系统评估策略与分析工具箱，为行业提供了科学、实用的指导框架，有助于推动寡核苷酸药物的稳健开发与质量控制。

参考文献

Carloni LE, Bou-Assaf G, Chanda A, Cui L, Elmekawy A, Farzan M, Joyce L, Majumdar R, Nazir Z, Rieder U, Shi E, Yin H, Zhang Y. Strategies for the evaluation and characterization of higher-order structures, supramolecular higher-order structures, and aggregates in oligonucleotide therapeutics. J Pharm Sci. 2025 Sep;114(9):103885.

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