无菌检查稀释剂/冲洗剂验证

路过一只蚂蚁 · 发表于 4 天前

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25版药典1107中“根据供试品的特性，可选用其他经验证的适宜溶液作为稀释液或冲洗液（如0.9%无菌氯化钠溶液）。”
这里所谓的经过验证的适宜溶液是要怎么验证，难不成和微限一样加一个稀释液/冲洗液+菌的组吗
如果考虑到向样品中加表面活性剂或中和剂的话，应当也是得单独做一个表面活性剂/中和剂+菌的组别吧

世间始终你好 · 发表于 4 天前

好问题 — 这确实不是“随便换个生理盐水就完事儿”的事，药典里说的“经验证的适宜溶液”就是要有实验数据证明该溶液用于稀释/冲洗时不会抑制目标微生物的生长、不会掩盖或改变检测结果，并且在必要时能中和样品自身的抑菌作用。下面把可执行的思路和常用的试验设计、判据给你列清楚（并标注了权威参考），你可以直接拿去做或写成SOP。

关键点（结论先说）

“经验证的适宜溶液”应证明：无菌/可控生物负荷、对检出微生物不具抑制性（即能恢复接种微生物的生长），并在遇到含有抑菌物质的样品时配合中和剂/表面活性剂完成中和验证（neutralizer efficacy + toxicity）。
验证思路不是单测一项，而是做一套对照：空白对照（接种液）、稀释液+接种菌、稀释液+样品+接种菌、若用中和剂/表面活性剂还要做中和效力和毒性试验。
判据常用两类表述：与接种对照比较不低于0.5 log 单位差或恢复率≥70%（各实验室/药典章节常用二者其一）。

推荐的实验/组别（最常用、可直接写进验证方案）基础前提：用药典/公司规定的代表性菌株（常见面板：一株革兰阳性、一株革兰阴性、酵母、霉菌；如 S. aureus、P. aeruginosa / E. coli / B. subtilis、Candida albicans、Aspergillus brasiliensis），菌悬按药典/USP预先标准化（目标接种量通常使最终稀释后在可计数范围，例 10–100 CFU/皿）。
A. 无菌性与生物负荷检查（对稀释液本身）

目的：确认稀释液/冲洗液在使用前为无菌或生物负荷在可接受范围（若商业无菌盐水则验证供应商证书并按批次放行）。

B. 稀释液/冲洗液的回收性（non-inhibitory test / recovery）

组别（每种代表菌至少做一套）：
- 接种对照（Inoculum control）：将标准菌悬直接加入中性缓冲或PBS，按常规稀释/接种，计数（这是参考恢复量D）。
- 稀释液 + 接种菌（Test）：将同样数量菌加入拟用稀释液（如0.9% NaCl）并按常规处理，计数（这是B）。
  3.（如样品存在）稀释液 + 样品基质 + 接种菌：评估基质是否有抑菌需配合中和剂。
判定：Test 与 Inoculum control 的差 ≤ 0.5 log（或恢复率 ≥ 70%）即通过。若不通过，稀释液被认为有抑制性，不能直接使用。

C. 若考虑“表面活性剂 / 中和剂”（两类验证必做）

中和剂毒性（neutralizer toxicity）：验证中和剂本身对微生物没有杀灭作用（中和剂+接种菌应恢复与接种对照相当）；
中和剂效力（neutralizer efficacy）：在含抑菌样品存在时，验证“中和剂+样品+接种菌”能恢复到接种量（或与接种对照的差 ≤ 0.5 log），同时“样品+接种菌（无中和剂）”应显示抑菌（否则可能样品本身无强抑菌）。
具体组别常见：
- 接种对照（Inoculum control）
- 中和剂 + 接种菌（toxicity control）
- 样品 + 接种菌（无中和）
- 中和剂 + 样品 + 接种菌（efficacy）
- 稀释液 + 接种菌（稀释液回收性）
判定：中和剂毒性组不应显著抑制（≤0.5 log 或 ≥70%恢复）；中和效力组需显著恢复抑菌样品的可计数菌至可接受范围（与接种对照差 ≤0.5 log 或 ≥70%）。参考 USP <1227> 的 neutralizer tests 设计。(DrugFuture, PMC)

D. 表面活性剂（surfactant）

若用表面活性剂帮助从样品释放微生物（如非溶于水的基质），需要做与稀释液同样的回收性验证（surfactant + 接种菌 vs 接种对照）；还需确认表面活性剂不会对培养基/平板造成干扰（如起泡、抑菌或影响菌落形态）。如果表面活性剂浓度对菌落计数有影响，需优化最低有效浓度并在SOP中固定。

具体数值/判据（常用、可直接采用）

恢复差异 ≤ 0.5 log10（即 test 值不得比对照低超过 0.5 log）；或
恢复率 ≥ 70%（(B/C)*100% ≥ 70%）—— 两种表述在文献与指导中都常见，选其一并在SOP里说明。

实验注意事项（实践层面）

必须用药典/USP 指定或常用代表菌并标准化接种量；每个菌株重复性要好，建议每组做 3 个平行。
中和剂成分要选对（不同杀菌成分用不同中和体系），并记录中和剂制备、用量、接触时间等；中和剂本身必须无毒性或其毒性需被校正。
若使用商业无菌0.9%NaCl注射剂：仍应有供应商批放证明 + 实验室批次放行确认（批内无菌/无抑菌性证据）。

推荐参考条目（用于SOP引用 / 写报告）

USP Chapter 〈1227〉 Validation of Microbial Recovery — 中和剂/回收验证方法、判据（0.5 log / 恢复率等）。
中国药典相关通则（1105/1106/1107）与微生物限度检查通则的实践说明（关于稀释液、表面活性剂使用的表述）。
近年关于中和体系验证与毒性/效力试验的研究/指南文章（示例文献总结）。

路过一只蚂蚁 · 发表于 4 天前

世间始终你好发表于 2025-8-9 17:17
好问题 — 这确实不是“随便换个生理盐水就完事儿”的事，药典里说的“经验证的适宜溶液”就是要有实验数据 ...

老师您好，想问一下ChP里有没有小于0.5或大于70%的要求，主要参考还是国内药典或者相关法规，另外如果考虑是既要使用中和剂也要使用特别的冲洗液，在方法学时将其混合为一种作为一组去接种是否可行，因为考虑其与供试品也是共同使用的，还是需要单独分开两组比较好

世间始终你好 · 发表于 3 天前

路过一只蚂蚁发表于 2025-8-9 22:51
老师您好，想问一下ChP里有没有小于0.5或大于70%的要求，主要参考还是国内药典或者相关法规，另外如果考 ...

短答先说结论：中国药典（ChP）通则本身很少把“0.5 log / 70%”写成必须的硬性数字要求，这些具体的数值判据在国内实践中常常借用 USP 〈1227〉 或 FDA 等国际指南给出的判据（即差异≤0.5 log 或恢复率≥70%）作为可接受的验证标准。为了合规与可解释性，建议在方法学验证/SOP 中明确采用并引用某一套判据（常见做法：采用 USP 〈1227〉 的判据），并把实验设计写清楚以证明稀释液、中和剂、表活、以及它们的组合对菌无毒性且能中和样品抑菌性。
下面把依据、风险点和可执行的实验设计（包含是否把中和剂+冲洗液混合成一组的问题）给你讲清楚 — 直接可拿去改SOP。

1) ChP 有没有明确写“≤0.5 log / ≥70%”？

查阅《中国药典》通则/微生物限度章节（如1105/1107）——通则要求进行回收/适应性验证、确认稀释液/冲洗液/中和剂“适宜”，但文本通常不逐字给出“0.5 log / 70%”作为唯一判据，而是要求证明所用体系不抑制微生物并能在需要时中和样品抑菌性。具体数值判据在国内外实践和技术文献中广泛采用 USP 的表述。
因此：合规且稳妥的做法是（A）在方法学里引用清晰的判据（例如采用 USP 〈1227〉 的“与接种对照差≤0.5 log 或恢复率≥70%”），并在SOP/验证报告里注明依据（ChP + USP/FDA/公司标准）。这样既回应了药典要求的“经验证”，又给出明确可检的判据。

2) 如果同时要用中和剂 AND 特殊冲洗液，能否把“中和剂+冲洗液”混合成一组去验证？短结论：可以，但必须同时做单独与组合两套验证（至少在方法学阶段）。理由与推荐设计如下。
原因：

中和剂和冲洗液（或表面活性剂）各自对微生物的毒性、对培养基的干扰、中和效力等可能不同；两者混合后可能出现协同毒性、互相中和失效或其它相互作用。只有对“组合体系”做验证并且与“各自单独体系”比较，才能说明在实际同时使用时仍满足回收/中和判据。FDA/USP 指南也强调要验证中和剂的毒性与效力（并验证所用稀释液/中和体系对代表性微生物不抑制）。

实验建议（方法学阶段，建议每种代表菌做3 平行）：

接种对照（Inoculum control）：接种到推荐的无抑菌缓冲（如PBS）——作为参考恢复量。
稀释/冲洗液 + 接种菌（diluent control）：评估冲洗液本身对菌的毒性/抑制。
中和剂 + 接种菌（neutralizer toxicity）：评估中和剂自身是否有毒性。
稀释液 + 中和剂（混合） + 接种菌（combined toxicity）：评估二者混合是否带来额外毒性（这一步是关键）。
样品（或样品基质） + 接种菌（sample effect，若样品本身有抑菌则会看到）：展示样品是否抑菌。
样品 + 中和剂（或中和剂+冲洗液混合） + 接种菌（neutralizer efficacy）：证实在样品存在时中和剂/体系能恢复可计数菌。
（可选）稀释液/冲洗液与表面活性剂的单独回收：如果表活用于释放菌落，也需评估其对细胞的影响和最低有效浓度。

判定：与接种对照差 ≤0.5 log 或恢复率 ≥70%（或你公司/注册要求的其他数值）即通过；中和剂毒性组与接种对照也应满足同样判据。

3) 实操建议与记录要求

把“单独（中和剂）/单独（冲洗液）/组合（中和剂+冲洗液）”都列入方法学验证表格，并把判定规则写死（谁是参考、可接受差值、重复数、菌株清单、接触时间等）。若组合通过且与单独一致，可在日常检验中只用组合体系，但首次方法确认/方法学验证阶段必须证明组合可行并留有数据支撑。
明确中和剂用量、接触时间、配制方法、贮存与有效期、供应商批号记录；对商业无菌0.9% NaCl 等仍建议做批次放行确认或引用供应商证明。

4) 如果你需要一个“最小可执行版”的验证/对照列表，我给你精简版（可直接放入SOP）

接种对照（Inoculum）
稀释液 (0.9% NaCl) + 接种菌
中和剂（配方） + 接种菌（toxicity）
冲洗液（配方/含表活） + 接种菌（toxicity）
中和剂 + 冲洗液 + 接种菌（组合毒性）
样品基质 + 接种菌（展示样品抑菌）
样品基质 + 中和剂（或中和剂+冲洗液组合） + 接种菌（中和效力）
判据：差 ≤0.5 log 或恢复率 ≥70%，并至少三重复。

5) 参考文件（你可直接引用到SOP/报告里）

中国药典（通则 1105 / 1107 等）— 关于微生物限度与稀释/回收性验证的原则。
USP 〈1227〉 Validation of Microbial Recovery — 常用“≤0.5 log / ≥70%”判据来源。
FDA Pharmaceutical Microbiology Manual（关于中和剂、回收和分类的说明）。

xqliu · 发表于 3 天前

这个解答比较到位，需要鼓励一下。

为了微生物 · 发表于前天 09:59

路过一只蚂蚁发表于 2025-8-9 22:51
老师您好，想问一下ChP里有没有小于0.5或大于70%的要求，主要参考还是国内药典或者相关法规，另外如果考 ...

AI回答的错漏百出

[方法验证及确认] 无菌检查稀释剂/冲洗剂验证

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